单细胞凝胶电泳(single-cell gel eiectrophoresis,SCGE)又称慧星试验(comet assay)是一项较新的电泳方法。自1978年被Rydcbert B.等人成功地用于检验DNA单链断裂以来,经过不断的改进,已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法,广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的遗传毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中。 1、SCGE 的检测原理 尽管SCGE 技术己应用近20 年,但其检测单个细胞DNA 损伤的确切原理还不甚清楚。初步认为,各种因素诱发细胞DNA 损伤后会影响DNA 的高级结构,使其超螺旅松散。这种细胞经过实验中细胞原位裂解、DNA 解链等过程后,电泳时,损伤的DNA从核中溢出,朝阳极方向泳动,产生一个尾状带,未损伤的DNA 部分保持球形,二者共同形成“慧星”。在一定范围内,“慧星”的长度(代表DNA迁移距离)和经荧光染色后“慧星”荧光强度(代表DNA 的量)与DNA 损伤程度相关,这样就可以定量检测单个细胞中的DNA 损伤。 2、SCGE 的操作方法 singh等人于1988 年描述的SCGE具体操作方法,被认为是经典的操作方法。其主要步骤有:将混有待测细胞的琼脂糖铺于载玻片上,凝固后浸入冷溶解液中使细胞裂解,在电泳液中解链后水平电泳,洗涤后用DNA 结合荧光染料染色,在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像,评价DNA 的损伤程度。改变相关的实验条件,可以检测DNA 不同类型的损伤,这是SCGE 的优势之一。如果在碱性溶液中溶解、解链、电泳,可以检测DNA单链断裂及碱不稳定损伤[;如果在冷溶解液中加入高浓度盐及其它变性剂,中性条件下溶解、解链、电泳,则可检测DNA 双链断裂。 3、SCGE 的主要计算指标 实验结束后,用荧光显微镜将“慧星”图像放大后拍摄下来进行分析。典型的DNA 损伤细胞荧光图像象慧星一样头尾分明。为了根据图像评价DNA的损伤程度,人们设计了一系列的计算指标。按其性质,大致可分为以下几类: 3.1 形状指标 |
定义TM 时将“慧星”尾部当作一个整体考虑,将头、尾部中心间距当作损伤DNA 的平均迁移距离。事实上尾部DNA 由不同DNA片段组成,不同片段迁移距离不同,即尾部DNA 的分布并不均匀。于是,Kent 等人提出“慧星矩”(comet moment ,CM)的概念。以“慧星”头部中心点为零点,沿电泳方向将“慧星”按一定的间隔分成若干个区域(80 个即可),分别测定每个区域的荧光强度(Di,代表该区域DNA 量)、该区域中心距零点的距离(Xi)、“慧星”总荧光强皮(Dt,代表总DNA 量),则CM 定义为∑ Di · Xi / Dt。实验表明,损伤因素作用剂量较大时,CM 与作用剂量间的相关性比TM 更为密切。近年来该指标也有所应用。 4、SCGE 的应用前景 检测外界因素对DNA 的损伤,SCGE 的检测结果同其它检测方法如程序外DNA 合成(UDS)等结果相关较好,而且SCCE能反映细胞群体中不同类型细胞对作用因素的不同反应,而不仅仅是群体细胞的平均效应水平,为确定遗传毒性因素的靶细胞提供了可能,也可用于肿瘤放、化疗抗性细胞的检出,为疗效评估和预后监测提供依据,同时该法方便易行,无需要求细胞处于生长状态,也无需同位素标记,其应用潜力是巨大的。但由于其理论基础不够明确,各实验室的操作方法差异极大,包括溶解液、电泳波的配方、溶解时间、电泳参数、DNA结合荧光染料的选择都远远没有标准化。评价各实验室结果也没有统一的标准,因此SCGE 有待于进一步的改进和完善。 |
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