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免疫电镜技术

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  将抗体进行特殊标记后用电子显微镜观察免疫反应的结果。根据标记方法的不同, 分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。如免疫铁蛋白技术是将含铁蛋白通过一种低分子量的双功能试剂与抗体结合,成为一种双分子复合物,它既保留抗体的免疫活性,又具有电镜下可见的高电子密度铁离子核心,因此用铁蛋白标记的抗体可通过电镜免疫化学的方法在电镜下定位细胞中的抗原。由于某些固定技术(如锇酸固定)对抗体抗原的结合有干扰,因此应采取较为温和的样品制备方法。
  是利用电子显微镜在超微结构水平上研究免疫反应的一项的新技术。用电子致密物质如铁蛋白等标记抗体,然后让其与含有相应抗原的生物标本反应,从电镜观察可见电子致密物质的所在位置,识别抗原、抗体反应的部位。由于电子显微镜的分辨力很高,故可准确地显示抗原所在部位。该技术是一种在分子水平上的抗原定位法,实际上是将细胞水平的荧光抗体技术的原理应用到分子水平上。此项技术在细胞抗原成分的定位、识别以及细胞形态和功能关系的研究上,已成为重要的方法。主要用于病毒、细菌等抗原定位、免疫性疾病的发病机理及超微结构免疫细胞化学研究等。

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原理 编辑本段回目录

免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类:一类是免疫凝集电镜技术,即采用抗原抗体凝集反应后,再经负染色直接在电镜下观察;另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合,在电子显微镜下观察,由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用,使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。

影响免疫电镜的一些因素编辑本段回目录

1.标记物  用于电镜观察的标记物有三类:一类是电子密度致密的标记物,如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。另一类则是放射性同位素,如135I、35S、32P、14C、3H等,第三类则是有独特形状的标记物,如血兰蛋白、噬菌体等。
对标记物的要求是:具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。两者各有其优点,铁蛋白电子密度致密。观察时反差大,优于酶标记,但铁蛋白分子量大(460 000),穿透能力差,所以适于细胞表面抗原的定位,另外铁蛋白的标记过程比较复杂。HRP分子量小(40 000),穿透力强,有利于标记抗体进入细胞内,适于细胞内的抗原定位。
2.固定剂  固定是免疫电镜较关键的一步,免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。
(1) 固定剂的要求:①不损害细胞内抗原的活性;②固定速度快、效果好;③分子量小,易于渗透;④固定后,不引起交联,造成空间的阻碍,影响标记抗体进入抗原位。
(2) 影响固定的因素有:①采用固定剂的种类;②固定剂的浓度,浓度过大,对抗原的活性有影响,浓度过小,固定效果差;③固定剂的pH;④固定剂的温度,一般采用2℃~4℃冷固定;这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提;⑤固定时间与温度有关,温度高,固定快,也与缓冲系的离子强度有关,离子强度大,渗透压大,穿透力强,固定要快。不同的固定剂,或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致;⑥与被固定的细胞类型有关。
目前常用的固定系统有:4%聚甲醛,1.5%~2%戊二醛,1%多聚甲醛+1%戊二醛,4%多聚甲醛+0.5%苦味酸+0.25%戊二醛,96%乙醇+1%醋酸。不论采用哪些系统,使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价,作为失活参考以再选择最适条件。
3.非特异性吸附  非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间,温度及介质等有关,其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释。一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度,用于标记染色可获得最理想的结果。因为低蛋白浓度有利于降低非特异性吸附。实际应用的蛋白浓度大致在0.50mg/ml~2mg/ml。工作效价一般在1︰20~1︰400,在实际工作中,将标记抗体或抗血清稀释到1︰100倍以上则可获得理想的阳性结果,而非特异性吸附必然降得很低。
工作浓度的选择是将标记抗体或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀释,做已知阳性标本的标记染色观察,取其阳性沉积物明显,而非特异性吸附最低的一稀释度做为工作浓度。
4.标记染色法  标记染色法分为直接染色法与间接染色法两种。前者的特点是特异性较高,敏感性低,标记抗体只能用于检测一种抗原。后者敏感性较强,一种标记抗体可用于多种抗原的检测。缺点是特异性较差。

酶免疫电镜技术编辑本段回目录

(一) 原理 
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度,借助于电子显微镜观察,证明酶的存在,从而对抗原进行定位。
(二)材料与试剂
1.PBS液  取NaCl 8.5g,Na2HPO40.85g,KH2PO40.54g,加水至1 000ml即可。
2.DAB溶液  取5mgDAB(3、3二氨基联苯胺)加入10mlTris-HCl缓冲液(0.05mMol/L pH 7.6),加1%H2O20.5ml~1ml。配制时,避光进行,现用现配。在显色完成冲洗过程中,要保持流水冲洗,防止非特异性物质积于标本上。
3.戊二醛固定液  取50ml 0.2Mol/L PBS缓冲液与25%戊二醛按以下比例配制:
0.2Mol/LPBS液         50     50    50    50    50 
25%戊二醛(ml)        4     6     8     10    12
重蒸馏水(ml)         46    44    42    40     28
固定液终浓度(%)     1.0    1.5   2.0    2.5    3.0
(三)操作方法
1.酶标抗体的制备  疫酶技术章。
2.取材 将培养细胞或悬浮细胞用0.1Mol/L PBS液冲洗,离心沉淀后,立即转入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2,4℃固定5min~30min(依抗原性质所定)。如病料为组织块,则取适当大小,先固定1h然后取出,以新的双面刀片切成50~100µm的薄组织再行固定1h~2h。
3.漂洗  以PBS液漂洗过夜,换液3~4次。
4.血清孵育,25℃1h或4℃过夜,孵育的标本放置于加盖的瓷盘内,底层垫数层纱布。防止抗血清干燥凝固,不易洗脱,造成非特异性吸附。
5.PBS冲洗3~4次,每次10min。
6.2.5%戊二醛再固定15min~30min。
7.PBS液冲洗3~4次每次10min。
8.酶标记抗体孵育;用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于25℃湿盆内孵育1h或4℃过夜。
9.PBS液冲洗3~4次每次10min或4℃漂洗过夜。
10.酶显色处理  将漂洗后的标本浸入DAB-H2O2底物溶液中,20℃,10min~30min。显色强弱与戊二醛的固定有关。若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11.常规包埋、切片、电镜观察  在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色,切片一般在2µm~4µm,切片后染色不存在通透困难的问题。无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色,最好在光镜下定位选择后,再做电镜定位包埋,这样目的性强,可减少工作量。
(四)结果判定
在已知阳性、阴性样品成立的前提下,凡出现棕色颗粒,即指示抗原抗体的存在,同时可观察到病毒颗粒的存在,判为阳性(+),否则判为阴性(-)。

铁蛋白免疫电镜技术编辑本段回目录

(一) 原理 
免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体,再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查,观察到铁蛋白抗体所在的位置,即抗原所在。
(二)材料与试剂
1.马脾铁蛋白
2.硫酸铵
3.硫酸镉
4.双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante  XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁,配制后放置4℃数天,以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成,应重配。
5.0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液
6.0.1Mol/L硫酸铵液
7.0.05Mol/L pH 7.4 PBS液
(三)操作方法
1.铁蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸铵液,并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值,正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。
⑵ 加入20%硫酸镉,使最终浓度为5%,混匀,4℃过夜。
⑶ 1 500g离心(4℃)2h,去上清。仍加2%硫酸铵至100ml,混匀,离心,去除不纯沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉,重复步骤⑵,离心,去上清。
⑸ 检查沉渣,置显微镜下检查,应具有典型的黄褐色结晶,结晶为六角形,双一四点结构,如结晶不典型,应继续重复以上步骤。
⑹ 以少量的蒸馏水溶解,再加50%饱和硫酸铵溶液,使之沉淀,离心,去上清。
⑺ 重复步骤⑹一次。
⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
⑼ 100 000r/min离心2h,去除上部无色上清液(约3/4总量),置4℃过夜。
⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤,使铁蛋白含量为65mg/ml~75mg/ml,分装,4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2.铁蛋白-抗体交联法
⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml~25mg/ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min,离心去沉淀。
⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml,以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白-XC液,4℃搅拌48h。
⑷ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜,以除去多余的异氰酸盐,再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析,使pH值恢复到生理水平。
⑸ 超速离心  以1.00×105g离心5h,去上清,沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮,再次离心,以除去未结合的IgG。
⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应,如果操作步骤严格,结果是满意的。
3.铁蛋白-抗体结合物处理标本
(1)将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min~60min。
(2)用冷的PBS液洗涤,离心。
(3)如是组织块,则在解剖显微镜下切成更小块,放入试管中,加入铁蛋白-抗体结合物置室温20min,不时振荡,
(4)以冷PBS液洗涤三次,离心。
(5)沉淀以2.5%戊二醛固定20min,以PBS洗涤。
(6)再以锇酸固定,脱水包埋。
也可以先超薄切片,再进行铁蛋白-抗体结合物染色。操作如下:
⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。
⑵ PBS液洗涤离心。
⑶ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中,再将袋置于吸水剂粉末上,待牛血清白蛋白成胶状物时,将透析袋移至2%戊二醛PBS液(pH7.5)中固定3h。
⑷ 取出,切成小块,以PBS液洗涤。
⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺ 滴一滴铁蛋白-抗体结合物于载网上。
⑻ 5min后,浮网于PBS液面,标本面向下,以除去多余的结合物。
⑼ 凉干后,滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽ 水洗、晾干、电镜观察。
(四)结果判定
在已知对照样品成立的前提下,凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在,判定阳性(+),否则判为阴性(-)。

非标记抗体免疫电镜技术编辑本段回目录

(一) 原理
标记抗体法虽然具有许多优点,但也存在一些难以克服的问题,如标记抗体的分子增大,对细胞膜和组织的穿透力减弱;化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响;结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合,影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素,通过一系统的非标记抗体的免疫学反应,对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab′)2,一个Fab片段与标本中的抗原结合,一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后,再加入铁蛋白与抗体结合,从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后,直接电镜观察。
(二)材料及试剂
1.待检病毒材料  如粪便,气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。
2.高速离心机
3.已知抗体
4.磷钨酸
5.琼脂糖
6.其它
(三)操作方法
1.经典法
(1)将被检病毒材料0.9ml,加1︰5~1︰10稀释的特异性免疫血清0.1ml充分混合。
(2)置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃过夜。
(3)以17 000r/min~23 000r/min离心90min。
(4)吸去上清,将离心管口倒置于滤纸上,吸去残留液体。
(5)沉淀物中加少量H2O混悬,用3%磷钨酸(pH6.0)负染20Sec~30Sec,滴加于400目铜网Fomnvar膜上,用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。
(6)在透射电镜下4×104倍观察。
2.快速法(琼脂扩散法)
(1)同经典法(1)、(2)步骤,制备免疫复合物。
(2)以生理盐水或pH 7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖,趁热浇注于洁净的载玻片上,每片3ml,待冷却凝固后,在凝胶面上等距离放置直径4mm玻璃珠数粒,再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2ml~3ml,冷却凝固后,取出玻璃珠,使凝胶形成凹孔。
(3)将普通滤纸剪成2×3cm大小,3~4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。
(4)在凹孔内,加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。
(5)将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用,20min~30min后,可将液滴的水分吸干,而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。
(6)在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20Sec,过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。
(7)于透射电镜4×104倍下观察。
(四)结果判定
直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入,大大提高了观察的敏感性。

免疫电镜胶体金标记法编辑本段回目录

  金标法是Faulk和Taylor(1971)提出的,并首先用于免疫电镜。它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质,使其与抗体相吸附,从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时,在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色,不需加外进行染色。在电镜水平,金颗粒具有很高的电子密度,清晰可辨。因此,免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面,并取得了要喜的进展,解决了一些过去未能解决的问题,80年代以来似有取代免疫电镜PAP技术的趋势。胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点:首先,手续不如PAP法烦琐,不需用H2O2等损伤微细结构的处理步骤,对微细结构的影响较少。其次,金颗粒具有很高的电子密度,在电镜下金颗粒清晰可辨,易于与其他免疫产物相区别。因此,金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。另外,利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体,是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。金标抗体还可加入培养液中,对培养细胞内抗原进行标记定位。曾有报告用金标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。由于金具有强烈的继发电子的能力,因此,不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察,也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。金标液无毒性,对人体无损伤。胶体金及胶体金标记物的制备见第五章 第3节 。在原位分子杂交技术在电镜水平的应用中,胶体金的标记术被科技工作者认为是当前最理想的标记物(详见第二十章 )。

  一、电镜水平的免疫金染色法

  应用于电镜水平的免疫法,可分为包埋前染色和包埋后染色,由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差,一般只用于细胞表面的抗原标记,如需穿透细胞膜,则需辅以冻融法或加入Triton X—100、皂素等活性剂,后者会加重细胞超微结构的破坏,因此,现较普遍采用包埋后染色,现分别介绍如下:

  1.包埋后染色

  (1)超薄切片厚50~70nm左右,载于200~300网孔的镍网上。

  (2)置1%H2O2内10min至1h(视树脂的硬度和切片的厚度而定),以去锇酸和增进树脂穿透性,有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时,此步可省略。操作时,滴入1%H2O2液1滴于蜡板上,将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片,有主张以1%过碘酸钾(KIO4)代替H2O2的。

  (3)双蒸水洗3次,每次10min,第1,2次洗法如(2),浮于液滴上,第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗,水流应有适当压力,但不宜过高强,用滤纸在网缘将水吸干。

  (4)浮于正常羊血清(1:50~1:100)滴上,室温30~60min,以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位。

  (5)PBS漂洗3min,洗1次(有人主张不洗)。

  (6)滤纸吸干,孵育于第一抗体血清滴上,先室温预孵1h,再置于4℃24~36h。

  (7)PBS漂洗3min,3次。

  (8)PBS(内含1%的牛血清白蛋白)pH8.2中,5min,此步为胶体金结合作准备。

  (9)胶体金标记抗体液1:30~1:100,淡红色为适宜稀释液,室温孵育10min至1h。

  (10)双蒸水洗3min,3次。

  如作双重染色,则应将镍网翻过来,用另一类抗体血清,重复上述步骤(2)~(10)。

  (11)5%醋酸铀(双蒸水配制)染5min,然后用双蒸水洗。

  (12)枸橼酸铀(或醋酸铅)染色5min,双蒸水洗净。

  (13)电镜观察。

  2.包埋前染色

  (1)组织经过适当固定,为增强细胞穿透性,可在固定液中加入皂角素(Saponin),使其浓度为0.01%,经含皂角认固定剂处理5~8min后,应用0.01mol/l PBS Ph7.4冲洗12h左右,中间换洗3~4次。

  (2)组织切片贴于明胶涂抹的坡片上,细胞可制成混悬液,用离心法操作或制成涂片。

  (3)0.05mol/l PBS pH7.4洗3min。

  (4)以1:5正常羊血清处理切片30min室温,以阻断非特异性吸附。

  (5)第一抗体4℃孵育20h后室温2h或过夜。

  (6)0.05mol/l TBS pH7.4洗3min×3。

  (7)0.02mol/l TBS pH8.2洗3min×3,为与胶体金结合作准备。

  (8)再次阻断非特异性吸附,同(4)。

  (9)以金标记的第二抗体(工作浓度1:40左右)在室温下孵育1h。

  (10)0.05mol/l TBS pH8.2洗3min。

  (11)0.05mol/l TBS pH7.4洗3min×3

  (12)1%锇酸(0.1mol/l PBS溶液)1h。

  (13)双蒸水洗15min。

  (14)系列酒精或丙酮脱水,包埋、超薄切片。(15)枸椽酸铅对照染色。

  为增加抗非特异性染色,有的实验室倾向在TBS中加入1%小牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA, Sigma)。理想的免疫金染色切片,背景应清洁,无残留的金或其他无机盐颗粒,金粒集中在抗原、抗体反应部位。要获得理想的免疫金染色切片,需注意的因素很多,其中主要的如:①抗体血清的高度特异性和亲和力;②被检组织应有较高浓度的抗原;③冲洗液的清洁度,冲洗的彻底程度以及整个过程中应用的各种器皿的清洁度等;④所有溶液最好用微孔滤过器(milipore filter滤过),滤膜孔径0.2~0.45μm,所有器皿应清洁和专用。整个操作过程应在湿盒内进行,以使载网保持湿润。

  二、胶体金标记蛋白A技术(Protein A-gold technique, PAg法)

  在电镜水平应用较为广泛,因该法具有特异性中、灵敏度高、方法简便和背景染色淡等优点。蛋白A的免疫特异性在第五章 已作了介绍,PAg复合物制备方法简便,作为第二抗体,无种属特异性,可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用,蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性,又能保持高度的稳定性,PAg复合物分子最小易于穿透组织。

  1.蛋白A—金(PAg)复合物的制备(Slot 和Geuze,1981)

  (1)胶体金液的制备,应用枸椽酸三钠还原法(见第五章 )。

  (2)待标记蛋白质和金溶液的准备,同前。注意点是用0.2mol/l K2CO3将金溶液pH调至5.9~6.2之间。

  (3)确定胶体金与蛋白A的结合用量比例。取一系列盛有0.1ml胶体金液的小玻璃管,分别加入不同量的蛋白A,5min后,再各加0.25ml 10%的NaCl。如加入的蛋白A浓度不够,不能稳住金粒,在电解质NaCl的影响下,金粒聚合沉淀,溶液由红变蓝。选择能防止溶液由红变蓝的最低浓度的蛋白A的量作为两者的结合比例。以枸椽酸钠法制成的胶体金每毫升约需要5μg蛋白A来结合,方能保证其稳定性。

4)胶体金与蛋白A的结合和纯化,依上法测得所需的比例超过10%,即每30ml胶体中加入2mg蛋白A,5min后,加入0.3ml PEG作为稳定剂,然后以15000r/min离心45min(不同方法制备的金离心速度不同),略带红色的松散的复合物沉淀即为PAg复合物。小心弃去上清液,加入PBS冲洗,如上,松散的PAg复合物置于PBS溶液中,按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作为稳定剂,保存于硅化的玻璃器皿中备用,也有主张将上述PAg复合物放入3~6ml 5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%叠氮钠混合液中,再离心,弃去无色上清液后,收取管底部浓缩纯化的PAg复合物置4℃保存。

  据文献报告,此PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。

  2.电镜水平的PAg染色法 PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法,可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在:①须1%卵白蛋白—PBs (pH7.4)或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液(pH7.4)来封闭非特异性的结合部位,而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清,因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合,从而给出假阳性结果;②在应用第一抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时,应用的PBS或TBS的pH应变更为pH7.4。在变更这两步后,其它可参照本节 中包埋前、后染色法进行。也可采用下列步骤进行包埋后染色。

  (1)载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上,室温约5min。

  (2)载网不冲洗,直接移至第一抗血清液滴上,在室温孵育2h或4℃18~24h。

  (3)PBS冲洗3min×2次。

  (4)将PAg原液稀释10~20倍,载网浮于该液滴上,室温孵育1h。

  (5)PBS冲洗5min×2次。

  (6)5%醋酸铀水溶液染色,水洗。

  (7)枸椽柄铅染色。

  (8)电镜观察。

  三、胶体金双标记技术(常用为蛋白A—胶体金)

  1.单面法以不同直径的金粒分别标记两种不同的抗体,以间接法先染第一种抗体,洗净后再染第二抗体。

  2.双面法以不同直径的金粒标记的抗体于镍网的两面分另进行免疫染色。本法的优点是可防止两种金标记的抗体的相互干扰,又可防止第一次应用的一抗与其相应的抗原相结合,占据了空间,第二次应用的抗体没有适合的空间使之与相应的抗原相结合。

  3.异种动物抗原—抗体染色法如一抗分别用人与兔抗血清,人抗组织抗原A,兔抗组织抗原B。第二抗体分别以不同直径金粒标记的抗人和兔免疫球蛋白。由于种属不同,两种抗血清不会互相干扰,在应用一抗和二抗时都可将两种血清一次混合使用,将四步减少为两步。

  4.金标记抗原检查法(Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法)此法是Larson(1977)年首先提出的,应用放射性同位素如125I或酶标记抗原进行染色。先用特异性抗体与组织抗原反应,标记的纯抗原又与特异性抗体反应。Larson(1980,1981)又在此基础上提出应用胶体金在电镜水平进行双抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是:双价的Ig抗体分子过量地加到有抗原的组织切片上,使分子的两个抗原结合点中有一个结合到组织抗原上,而另一端可与标记金的抗原起反应。双标记时,预先将两种不同的抗原标以不同直径的金粒,可分别与相应的第一抗体相结合,从而显示出两种抗原在组织切片的定位。此法的优点是标记物所显示出的组织抗原的部位经过两次选择,标记了抗原只能与相应的特异性抗体相结合而不能与切片中非特异性Ig相结合,因此具有较高的特异性。但由于使用此法时需备有与欲检抗原相同的纯抗原,并要对不同抗原分别进行标记,非一般实验室所能做到,所以至今尚未被广泛应用。

  双面金标记法操作程序(Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982).

  (1)镍网面A(树脂包埋)

  ①蒸馏水冲10min。

  ②10% H2O2蚀刻10min室温

  ③10%正常血清(以0.5mol/l Tris缓冲液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀释,简称TBT缓冲液)室温30min。

  ④以滤纸吸去多余液体,覆于特异性第一抗体1:500(Tris 缓冲液,pH7.4,含1%BSA和0.1%叠氮钠)4℃,孵育过夜

  ⑤彻底清洗,应用0.5mol/L Tris缓冲液pH7.2,不含BSA

  ⑥继之用0.5mol/L Tris缓冲液pH7.6,含1%BSA冲洗

  ⑦0.5mol/L Tris缓冲液pH8.2,含1%BSA,室温孵15min

  ⑧羊抗兔IgG标记以15nm金粒,应用0.5mol/l Tris缓冲液pH8.2、含1%BSA稀释1:40,孵育2h,室温

  ⑨0.5mol/L Tris缓冲液pH7.4 冲洗

  ⑩蒸馏水冲洗

  (2)镍网面B,重复①~⑩,只在第④时更改另一特异性一抗,在⑧时羊抗兔IgG标记以5nm金粒。

  (3)铀铅双重染色,电镜观察,可见二种不同直径金粒标记。

  注意事项:①所有溶液均须经加有微孔滤纸(0.45μm孔,国内外现均有商品提供)的注射器过滤,过滤后直接以注射器冲洗。②滤纸最好用无纤维吸水滤纸。③冲洗在胶金标记技术上是个决定性关键,仅次于抗体血清的纯度。笔者的体会是一般应漂洗3×5min,以注射器喷水漂洗效果优于杯漂洗法,但漂洗水流需与网面平行,勿使水压破坏切片。

  四、免疫电镜金—银法染色技术

  关于免疫金银细胞化学的原理、试剂配制和光镜显示技术在本书第五章 已作了较详尽的叙述。免疫金银细胞化学技术说可应用于电镜水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步骤如下:

  (1)组织固定振动切片机切片10~30μm。

  (2)人3%正常羊血清,含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min,以封闭非特异性结合部位

  (3)1%硼氢化钠的PBS孵育30min。

  (4)一抗37℃,2h。

  (5)PBS含0.1%BSA pH7.4 冲洗3min×3次。

  (6)PBS含0.1%BSA pH8.2 冲洗3min×3次。

  (7)人10~15nm金标羊抗兔抗血清,工作浓度约1:10,37℃孵育45min。

  (8)硝酸银液物理显影(详见第五章 第六节 )。

  (9)在解剖显微镜下取免疫反应阳性部位,人1%锇酸后固定20min,常规脱水,树脂包埋。

  (10)超薄切片机切0.1μm左右半薄切片,定位阳性反应部位,制超薄切片。如有暗视野微镜则更有助于定位。在暗视野前景下,金银粒呈金黄色闪光颗粒,即使微量金银也可定位,微镜则更有助于定位。在暗视野前景下,金银粒呈金黄色闪光颗粒,即使微量金银也可定位。

  (11)铀—铅电镜染色,电镜观察。

  免疫金银法敏感度高,金银颗粒电子密度高,反差强;应用包埋前染色可先定位阳性反应部位再作电镜超薄切片,获得阳性反应机率高,特别适用于含微量抗原的部位,如突触等。其不足是须经暗室显影,手续较烦杂,包埋前免疫染色易增加非特异性染色。另外,由于单个金粒周围结合的银粒不是固定的,受多种因素影响。因此,电镜免疫金粒染色法的金粒银粒计算不适于做半定量观察,误差较大。

凝集素电镜标记技术编辑本段回目录

  凝集素的特性及标记原理详见第五章 ,近年来,凝集素电镜标记技术应用日益广泛,且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多,常用的有凝集素—酶(常用为HRP)、凝集素—生物素—酶电镜标记技术。现将凝集素—酶电镜标记技术(包埋前染色)简介如下(Sterit 和Kreatzberg,1987)。

  (1)固定:常用为PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如为取脑组织,可将已藻注动物在4℃过夜,次日取脑组织置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸钠缓冲液(含7.5%蔗糖)中漂洗。

  (2)振动切片机(Vibratome)切60μm的厚片。

  (3)切片孵育在PBS(内含0.1mol/l CaCl2、Mgcl2和MnCl2)10min(有作者主张此步可省略)。

  (4)为增强细胞通透性,切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl2水溶液中,pH7.8,37℃孵育30min。

  (5)PBS洗3次,每次2min。

  (6)凝集素—HRp 1:10 在PBS中(含0.1%Triton X--100)4℃过夜,最好不断轻轻振荡。

  (7)PBS洗3次,每次2min。

  (8)DAB-H2O2显色。

  (9)1%OSO4水溶液固定。

  (10)系列酒精脱水,EPON包埋,切片。

  (11)电镜沿—铀双染观察。

  凝集素呈高电子密度常沉积在细胞膜上,易与电子染色相区别。

扫描免疫电镜技术编辑本段回目录

  扫描免疫电镜技术可为研究细胞或组织表面的三维结构与抗原组成的关系提供可能性。

  (一)标记物

  应用于扫描电镜的标记物应能在扫描电镜可分辨的范围内,并能对细胞或组织抗原有较好的定位能力。在选择标记物时应根据研究目的而定,如标记细胞等由于体积较大,可用体积大的标记物;如鉴别阳性(标记细胞)与阴性(未标记细胞),而要定位受体等则需选用较小的,易于辨认的标记物。

  常用的标记物为颗粒性标记物。依其特性可分为:

  1.蛋白类 如血蓝蛋白、铁蛋白等。

  2.病原体类 如烟草花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、噬菌体T4、大肠杆菌f2、噬菌体等。

  3.金属颗粒胶体金、免疫金银标记技术和同位素放射性自显影的银颗粒等。其中以金属类颗粒标记物应用最为广泛。最常用的是胶体金,胶体金商品提供的直径从3~150nm不等,扫描免疫电镜常用的金颗粒直径在30~60nm左右为宜。由于金本身系重金属,有较强的发射2次电子的作用,故不需喷镀金属膜,这是胶体金应用于免疫扫描电镜的标记优于其它标记物之处。免疫金银染色能加强细胞或组织表面金属颗粒聚集的密度。金、银粒在电镜显示为电子密度高,外形清晰的颗粒易于识别和定位。病原体标记物主要利用其特异殊的外形和结构以达到标记定位的目的,如噬菌体T4形似星形的球拍,头部大约100nm直径,呈六角形星状,尾长约100nm,由颈部与头部相接;烟草花叶病毒为15×30nm的杆状病毒,而南方菜豆花叶病毒是直径25nm的园形颗粒,这些病原体的典型外形很易于辨认。铁蛋白由于含有致密的铁离子核心具有较高的电子密度,从而达到标记定位的目的。血蛋白是由海螺类软体动物中提取的多分子聚合物,其外形为35×50nm的柱状体,多应用于病毒研究,但也有利用血蓝蛋白与过氧化物等的糖蛋白部份可与凝集素相结合的特性,进行细胞膜受体的定位。

  (二)免疫标记方法

  金属类标记物的免疫标记法同切片免疫染色,即将标记物与抗体相结合,通过直接或间接法显示抗原部位。胶体金可与蛋白A相结合后与IgG分子中的Fc 段相结合。哪与卵白素(a-vidin)相结合可与结合抗体的生物素(biotin)反应。免疫金银染色法在胶体金标记后,再进行银液显影。病毒(包括噬菌体)标记物多采用不标记抗体法,即搭桥法。此法的原理是采用同种动物制备抗原的特异性抗体与标记物抗体(例如兔抗A抗原与兔抗HRP)。再用另一种动物制备第一种动物血清抗体的抗体(例如羊抗兔IgG抗体)。利用后者为桥,把抗原的特异性抗体与抗标记物抗体结合起来,后者再与标记物结合,以达到定位抗原的目的,其基本原理与PAP法类同。病原体免疫标记可不用标记物显示,而利用其形态学特征定位或采用抗原抗体凝集法,其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特异性抗体在与相应的抗原反应后,使后者之间发生交联而凝集,经浓缩后用阴性染色法(负染)便可在电镜下显示定位部位。

  (三)扫描免疫电镜的具体操作步骤

  1.标本处理

  (1)细胞悬液:用10ml PBS 内含1mg/ml牛血清白蛋白(PBS—BSa )悬浮细胞,离心250g,5min×2。加入PBS—BSA 至105~106细胞/ml,振摇成单细胞悬液。BSA能减低生物标本的非特异性吸附,但注意浓度应适宜,过高会减弱特异性反应。

  (2)细胞附着于固体支持物:由于固定与免疫标记的孵育过程会引起细胞凝集,妨碍细胞表面的暴露,而且反复的离心与悬浮会导致细胞表面形态的改变。因此,通常将悬液中的细胞粘附于过滤膜或涂有带正电荷聚合物的盖玻片上,在粘附之前可依(1)法清洗标本,以除去细胞表面的附着物。固体支持物可用涂有多聚—L—赖氨酸薄膜的载片或直径13nm、孔径0.22或0.45μm的过滤膜,载片制备方法:多聚—L—赖氨酸(Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于载片上,4℃30min后倾倒掉表面液体,令其自然干燥。注意载玻片事先需要清洁液浸泡,水漂洗过夜,然后浸泡于乙醇或丙醇中,用前取出自然干燥或用绸巾拭干。将细胞悬液(如细胞数少可事先离心,取沉淀细胞),滴于滤膜或载片上,由于多聚赖氨酸的粘附性,在固定及免疫标记过程中细胞不至于脱落。但注意勿使细胞干燥。

  (3)组织切片与固体组织:组织切片如为石蜡包埋应预先脱蜡,由二甲苯经梯度酒精至水。组织切片与固体组织(勿过大)均应以PBS—BSA冲洗,并保持湿润避免干燥。

  2.固定

  (1)固定前用PBS—BSA冲洗5min×3。

  (2)选择加入适合的固定剂;可为4%多聚甲醛+0.1%~0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸缓冲液中。室温固定10~60min,或4℃30~120min。

  (3)PBS—BSA冲洗5min×3。

  (4)除去残留的自由醛基,选以下任一方法:

  ①0.5mg硼氢化钠/1ml PBS 10min(新鲜配制)

  ②0.05~0.2mol/l 甘氨醊或赖氨酸—HCl/PBs 30~60min。

  ③0.1~0.5mol/L氯化钠/PBs 30~60min。

  ④PBS—BSA冲洗5min×3。

  3.免疫标记与透射免疫电镜的原则及步骤基本相同。

  免疫金银染色法举例(张留保等,1997)

  (1)血细胞以PBS—BSA冲洗5min×3。

  (2)2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定,4℃,1h

  (3)PBS或TBS反复冲洗5min×3。

  (4)胶体金免疫标记程序(略)

  (5)暗室显影液显影

  (6)扫描电镜样品制样

  (7)观察

  作者在血细胞膜外显示了密集的金银粒标记(特异性标记膜的谷胱甘肽过氧化物酶及激素肽)。

  4.常规扫描电镜标本处理

  (1)PBS—BSA冲洗5min×3。

  (2)后固定:2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液,时间视样本大小而定,一般室温30min左右。

  (3)PBS—BSA洗5min×3。

  (4)1%四氧化锇后固定1~2h

  (5)系列梯度乙醇或丙酮脱水

  (6)临界点干燥或冰冻干燥

  (7)喷镀碳与金

  (8)扫描电镜观察

冷冻蚀刻免疫电镜技术编辑本段回目录

  冷冻蚀刻法(Freeze Ftching),也称冷冻复型法(Freeze Replica)或冷冻切断(Freeze Fracture),是研究生物膜结构的重要方法之一。其主要步骤首先是将样品在液氮中冷冻,然后放到真空喷镀仪中切断,切断后的切面上有细胞器,其间还有冻成洋的水分。再加热使冰升华,将水份蒸发,把细胞器的膜结构暴露出来,这一步骤就称为冷冻蚀刻。如不进行蚀刻就称为冷冻切断。向暴露的膜结构上喷镀铂—碳投影,再喷碳来加固。这样就在切断的样品表面形成一层复型膜。在此复型膜上印下了细胞切面的立体结构。从真空中取出样品,把复型膜下面的组织腐蚀掉,再把复型膜捞在铜网上,在透射电镜下观察复型膜。

  关于生物膜的分子结构,目前被大家公认的并为冷冻复型电镜观察所证实的是流动镶嵌型,即脂质—球状蛋白质镶嵌模型。依照这上模型学说表明,生物膜是一种流动的、可塑的、镶嵌蛋白质分子的脂质双分子层的膜;脂质双分子层中每一分子分别具有两极,一端为亲水极,朝向膜的内、外表面,而另一端的疏水极朝向膜的中线部位,两排分子彼此相对,构成生物膜膜性结构的基础。蛋白质分子彼此相对有嵌入性和表在性两种,前者大约占蛋白质总量的3/4左右,外形近似球状,镶嵌在脂质分子层的不同深度内,而后者则大多附着于细胞膜的胞质面。在冷冻劈裂后,生物膜的水平断面大多发生在单位膜的疏水极。因此,膜的亲水部,分别命名为PS(与细胞质,核质或线粒体内基质相邻的面)和ES(与细胞外间隙或细胞内间隙或细胞内间隙相邻的面,如内质网腔、核质间隙、线粒体内、外膜之间的腔和其它各种泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分别叫做EF(面向细胞质、核质、或线粒体基质的面)和PF(向细胞外间隙或内间隙的面)。从70年代初期开始,冷冻蚀刻免疫电镜技术已开始在应用,但由于免疫标记必须在冷冻蚀刻步骤以前进行,所以仅能标记细胞外表面(ES)。80年代开始建立了断裂—标记细胞化学方法,将细胞膜劈开后,中央的两侧断面(EF与PF)以及各种细胞器的膜的各个表面及细胞质与核质都能被标记,为此技术的广泛应用创造了条件。应用此法还可对抗原与受体分子进行定量统计。

  1.冷冻蚀刻表面标记免疫电镜技术

  (1)新鲜或固定的细胞进行直接法或间接法免疫标记。

  (2)PBS(pH7.5)冲洗3min×2,加入1mmol/l MgCl2蒸馏水洗洗3min×3,离心沉集细胞。

  (3)将细胞团置于小纸板上,入液氮冷却的Freon中,取出入冷冻蚀刻仪中进行断裂操作,再于-100℃蚀刻1min 。

  (4)制做断裂面复型。

  (5)再次氯酸钠清洗复型,蒸馏水洗后进行观察。

  本法可显示断裂暴露的PF位于中央,周围则是蚀刻后露出来的ES,标记物只出现在ES上。

  2.断裂—标记免疫电镜技术

  此法是先进行冷冻断裂,再做免疫标记,从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。

  (1)临界点干燥法

  ①固定:1.0%~2.5%戊二醛PBS液4℃1~2h,PBS冲洗3min×3。

  如为细胞悬液,可加入30%BSA后加入1%戊二醛,使BSA凝胶化,将凝胶切成2mm左右的小块,用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。

  ②冷冻断裂,将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中,培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中,用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。

  ③解冻,置碎块于30%甘油—1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。

  ④置换甘油,放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油,PBS冲洗,3min×2。

  ⑤免疫标记。

  ⑥1%锇酸,室温固定30min。

  ⑦系列梯度乙醇脱水,临界点干燥,喷镀铂—碳膜,次氯酸钠清洗复型,蒸馏水洗,捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察。

  (2)超薄切片法

  步骤:①至⑤同临界点干燥法。

  ⑥1%锇酸,室温固定2h,系列酒精或丙酮脱水,常规电镜包埋。

  ⑦切半薄片,光镜定位合适的断裂部位,再切超薄切片,铀铅染色,透射电镜观察。

  断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术,常用的如刀豆球蛋白(Con A)-- 胶体金免疫标记技术,Con A 能与细胞膜中的甘露糖结合,能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的EF面,有助于糖蛋白在超微结构水平的定位。

电子显微镜免疫细胞化学技术与其他技术的区别编辑本段回目录

  一、组织固定与取材

  在这方面的要求是即要保存良好的细胞超微结构,又要注意保持组织的抗原性。因此,选用固定剂不宜过强。常用的免疫电镜固定剂有多聚甲醛—戊二醛混合液和过碘酸-赖氨酸—多聚甲醛液(Periodate—Lysine –Paraformaldehyde简称PLP液)。也有采用Bouin氏液、Zamboni氏液或4%多聚甲醛液(其配制法见附录)。国外不少文献推荐应用PLP液于免疫电镜技术,认为该固定液对含糖类丰富的组织固定效果特佳,因为组织抗原绝大多数由蛋白质和糖两部分组成,抗原决定簇位于蛋白部分,有选择性地使糖类固定,就可使抗原性稳定。PLP液中过碘酸能氧化糖类,使其产生醛基,再经赖氨酸作用,使新形成的醛基分子间和分子内相互连接,稳定组织抗原。但赖氨酸价格较贵,不如多聚甲醛戊二醛固定液经济、简便、效果佳。在取材方面,免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。

  二、免疫染色

  分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。

  1.包埋前染色  即先行免疫染色,在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出,修整成小块,按常规电镜方法处理,经锇酸固定、脱水、包埋。如果特异性免疫反应的范围太小,为了准确定位,可作第二次包埋,即第一次包埋时将组织置于两层thermanox塑料片之间,中夹环氧树脂如夹心面包式,进行高温聚合,然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的组织,以中层较为理想。表层因受机械修整,结构往往保存不好,深层因抗体不能透入,免疫反应弱或无。在作超薄切片前应先切半薄切片,寻出免疫反应阳性部位。根据作者经验,半薄切片可在相差显微镜下不染色进行观察(指PAP染色法),免疫反应部位呈黑点状。在HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上,免疫反应部位呈棕黄色。据此定位作超薄切片,可大大提高阳性反应检出率。为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆,可取相连续的起薄切片,分别以两个铜网捞取,其中之一进行染色观察,另一以铀单染色或不染色进行对照观察。

  包埋前染色法的优点是:①切片染色前不经过锇酸后固定、脱水及树脂包埋等过程,抗原未被破坏,易于获得良好的免疫反应。②可在免疫反应阳性部位定位作超薄切片,提高电镜下的检出率。特别适用于含抗原量较少的组织,但由于经过一系列的免疫染色步骤,常出现一定的超微结构损伤。

  2.包埋后染色  组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片后,再进行免疫组化染色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色,故又名之载网染色(on grid staining)。必须指出的是:①后固定中是否应用四氧化锇存在不同意见,作者经验一般以不用四氧化锇为佳,或尽量缩短在四氧化锇中停留的时间。有作者认为,从理论上讲,四氧化锇具有保存抗原的作用,但实践证明应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。②在载网染色过程中,铜网易与化学物质产生反应,故需选用镍网或金网。③在免疫组化处理的全过程中,应注意保持网面的湿润,网面干燥会影响抗体活性。本法的优点是超微结构保存较好,方法简便,阳性结构有高度的可重复性,还能在同一张切片上进行多重免疫染色。但抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失;环氧树脂中的环氧基,在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质;包埋在环氧树脂中的环氧基,在聚合过程中可能与组织成份发生反应而改变抗原性质;包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。因此,免疫组化工作者曾试图以不同的方法如饱和苯溶液,无水酒精中NaOH饱和溶液或乙氧化钠溶液等以减少或去除包埋剂,取得不同程度的效果。现普遍采用的是在进行免疫染色前,以H2O2液蚀刻数分钟,以去锇和增强树脂的穿透性。

  3.超薄冰冻切片  按照Tokuyasu建立的方法,将组织置于2.3mol/L蔗糖液中,以液氮速冻,在冰冻超薄切片机上切片,切片厚度可略厚于常规树脂切片。冰冻超薄切片由于不需经固定、脱水、包埋等步骤,直接进行免疫染色,所以抗原性保存较好,兼有包埋前和包埋后染色的优点。

  三、包埋

  (一)树脂包埋

  国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法,可直接脱水后包埋,也可将小片组织或半薄切片贴在载片上,将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化,进行原位包埋。

  (二)低温包埋

  常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序,组织抗原性可能全部或部分丢失。因此,在免疫电镜技术方面,国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等,后者需配备冰冻超薄切片机,且技术难度较大,不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代,80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用,为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道,国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate,GMA),Lowicryls, LR White和Lr Gold等,目前国外生产厂家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下:

  1.Lowicryls 是丙烯酸盐(acrylate) 和甲基丙烯酸盐(methacrylate)化学物质,包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列产品(Polysciences INC),其特点是能在低温下保持低粘度(K4M:--35℃;HM20:-70℃;K11M、HM23:-60℃~-80℃)和具有在光照射(紫外光,波长360nm)下聚合的能力,它的光聚合作用与温度无度。其中K4M和K11M具有亲水性,特别适合于免疫细胞化学的应用,因它能较好地保持组织结构和抗原性,减少背景染色。HM20和HM23具疏水性,能产生高反差图像,适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多,现侧重介绍如下:

  (1)包埋剂的配制:商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成:单体(Monomer),交联剂(Crosslinker)和引发剂(Initator)。调整单体和交联剂的比例,增加交联剂的量,组织块的硬度增加。中等硬度的组织块,其配制比例如下:

  K4M:单体   17.30g

  交联剂  2.70g

  引发剂  0.10g

  K11M:单体  19.00g

  交联剂  1.00g

  引发剂  0.10g

  作者的经验,可用微量注射器加针头抽取后,注入棕色的玻璃容器避光,用玻棒轻搅3~5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌,以防氧的气泡进入包埋剂中。

  (2)生物样品处理程序(Lemanski 等1985)

  ①动物麻醉取材,以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在9℃固定2h。

  ②磷酸缓冲液含7%蔗糖,pH7.2,冲洗过夜,0℃

  ③0.1mol/L 磷酸缓冲液,pH7.2,冲洗,0℃

  ④脱水:65%乙醇,1h ,0℃

  80%乙醇,2h,-35℃

  Lowicryl K4M:80%乙醇=1:11h -35℃

  Lowicryl K4M:80%乙醇=2:11h -35℃

  100% Lowicryl K4M 1h -35℃

  100% Lowicryl K4M 过夜-35℃

  ⑤包埋:新鲜K4M置于胶囊内,将组织移入,在-30℃~-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W(Ladd Research Industries Burlington VT)相距30~40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡,照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2~3天,可增加其硬度,便于切片。

  (3)免疫染色

  ①切片(厚50~70nm)贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸(0.25~0.45μm)滤过。

  ②正常羊血清30min。

  ③第一抗血清(PBS稀释),37℃2h。

  ④可用烧杯法(或塑料壶喷洗法),以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min,然后在第二烧杯中洗荡1h 。

  ⑤正常羊血清30min。

  ⑥第二抗血清(胶金标记抗体)以正常羊血清稀释为1:1,以镍网置于血清滴上孵育1h。

  ⑦冲洗如④。

  ⑧覆于2%OSO4水溶液上,30min。

  ⑨冲洗如④。

  ⑩干燥后在电镜下观察。

  (4)Lowicryl K4M快速包埋染色法(Altman等1984)

  ①包埋剂的配制:单 体13g

  交联剂2g

  引发剂75mg 

  ②生物样品处理:除了聚合这一步骤外,下列所有步骤都在20℃进行。

  1)组织用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸缓冲液,pH7.4,在20℃固定1~2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。

  2)脱水:在50%、75%和90%的双甲基甲酰胺(Dimethylformamde,DMF)内系列脱水,每步10min。

  3)浸透:Lowicryl K4M:DMF=1:2  10min

  Lowicryl K4M:DMF=1:1  15min

  100% Lowicryl K4M  20min

  100% Lowicryl K4M  25min

  4)包埋与聚合:组织移入装满K4M的胶囊中,以紫外线灯照射聚合(紫外线灯条件同上),灯和组织距离10cm,4℃照射45min,组织块在室温进行超薄切片(切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面)。

  5)以覆有碳膜的镍网捞取切片。

  6)免疫染色。

  整个包埋时间仅需4~5h。

  Lowicryls 应保存在暗处,-4℃,该物质有刺激性,在配制时应戴手套,以免触及皮肤。在通风橱内操作,以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛,应立即以水冲洗局部,氧化重金属如KmnO4能与包埋剂作用而影响染色效果,以不用为佳。

  2.LR White 和Lr gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂,具有极低的粘度(8cps)和较强的嗜水性,因此有较强的穿透性,有利于抗体(或抗原)和免疫化学物质穿过LR树脂,达到组织结合部位。在免疫细胞化学的光镜(半薄切片)和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至70%乙醇即可,能较好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在国外提供厂家有 Poly-sciences INC等,Lr gold是一种光引发低发低温聚合的包埋剂,对于免疫细胞化学特别适用,能最大限度地保持组织的抗原与抗体活性,其最佳光聚合温度在-25℃,在聚合后呈现金黄色,因而得名。Lr white可在热和冷两种情况下聚合,热聚合在60℃,24h,冷聚合在-25℃,需加加速剂(accelerator)调整配制比例。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。

  3.GMA  是乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA)的缩写。远在60年代,电镜工作者就试图将其作为生物包埋剂应用于光镜和电镜。GMA作为电镜包埋剂的优点是电子密度大,影像反差好。但存在三个主要缺点:一是包埋聚合后的组织块很脆,不易修整和切片。二是聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。三是缺乏稳定性,不能承受电子束的轰击,包埋剂遇热升华,造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。聚合后的环氧树脂有良好的塑料稳定性,能承受电子束的轰击不变形,而且影像反差好,分辨率高,但其半薄切片染色不够满意始终是个有待解决的问题。而GMA包埋切片的染色效果明显优于环氧树脂。于是电镜工作者如Leduc和Bernhard(1986)尝试以增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸酯和少量水外,并加入适量的增塑剂如聚乙二醇400(PEG400)以改变其硬度,加入适量的闻联剂乙烯二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate)以增强其抗电子束轰击的稳定性。为避免聚合时过快,产生高温,损伤组织结构,选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰(Benzoyl Peroxide),温度范围-10℃~-30℃。经过不断的配制改进,现GMA已广泛应用于半薄切片(1~3μm)的光镜观察,特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。现将GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法简介如下:

  (1)GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂,用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳,在振荡器上振荡5min,过滤以除去氢酯,以免影响聚合。

  (2)包埋剂的配制:

  a. 100% GMA          66.5ml

  N—甲基丙烯酸丁酯       28.5ml

  5%乙烯二甲丙烯酸酯       5.0ml

  1.5 %过氧体苯甲酰       1.0g

  1.0%PEG 400          1.0ml

  b.A液:

  GMA单体液           90ml

  PEG 400           5~9.4ml

  过氧化苯甲酰        0.2~0.69g

  搅拌溶解后置棕色瓶内;   4℃保存。

  B液:

  PEG 400          20ml

  二甲基苯胺        1ml

  应用时A:B按10:1比例充分混合(张承志等1986)。

  (3)生物样品处理:组织固定可用PLP液或1%戊二醛溶液(磷酸缓冲液配制,pH7.4)。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。以上步骤可在室温或4℃进行。

  (4)包埋聚合:组织移入盛潢包埋液的胶囊内,先放在真空泵内以去除包埋液中的气泡,然后在4℃,以紫外线灯(波长360nm)在距胶囊底部10~20cm处进行照射12~16h,以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后,将胶囊丢入热水中以去除胶囊外壳。

  (5)切片贴在镍网上,按PAg技术进行包埋染色,其区别于EPON包埋剂者,在于GMA包埋切片染色所需时间较短,在第一抗血清中,GMA室温只需孵育1h,而EPON包埋切片需16~20h;在第二抗血清,即Pag 复合物中室温30min,而EPON包埋切片需1h。铀、铅双染后,电镜观察。

  低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。

  四、对照试验

  为确定方法的特异性,免疫电镜技术也需进行对照试验(同第一章 )。

  总之,不论哪一种免疫电镜技术都面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾,如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存,但对抗原活性有影响,而H2O2能增加树脂穿透性,但对微细结构有损伤,能使反应部位产生孔洞。在生物样品处理过程中,应同时注意到这两个方面。其次,每次免疫染色中的清洗工作应注意彻底,否则非特异性产物和其他污染物会影响特异性反应产物的显示和观察。根据作者经验,以塑料水壶加锥形喷水头喷洗,与镍网面成平行方向,即顺网面喷洗,较之目前通用的杯水洗涤法易于达到清洁目的。冲洗的残留水滴以滤纸吸干时,应注意不要触及载网本身。可将滤纸剪成三角形,以尖端接触水滴,即可达到吸干水份的目的,整个过程中,必须应用双蒸水,容器应专用。

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