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生物芯片技术在药物研究中的应用前景(图)

标签: 生物芯片 药物研究 应用

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1991年,美国Stephenfodor等提出了DNA芯片的概念,随着人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)的实施,生物芯片术已成为基因组计划中的一种重要技术手段。生物芯片(biologicalchip或biochip),把生化分析系统中的样品制备、生化反应和结果检测三个部分有机地结合起来连续完成。与传统的检测方法相比,具有高通量、高信息量、快速、微型化、自动化、成本低、污染少、用途广等特点。生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片或肽芯片、细胞芯片、组织芯片、元件型的微阵列芯片(如由微电极、凝胶元件、微陷阱等构成)、通道型微阵列芯片(如由微通道、反应池等构成)、生物传感芯片等。

目前应用最多的生物芯片形式是以基因序列为分析对象,以DNA杂交技术为基础的基因芯片(genechip),又称为DNA芯片(DNAchip)或微阵列(microarray)。按照芯片上固定的NDA种类不同,基因芯片可分为cDNA和寡核苷酸等芯片。按照用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片等。按照芯片点样制作方法不同可分为原位合成芯片、微矩阵芯片(分喷点和针点)及电定位芯片。

世界上一些大型制药公司将生物芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、药物筛选、基因药物开发和合成等领域,都已建立芯片设备、技术,开展药物研究。

1、在药物筛选中的应用

传统的药物筛选是从研究病理生理的生化途径开始,从生化代谢途径中找出对病变起关键作用的受体或关键的酶(即靶分子),将受体或酶从动物组织内提取纯化,然后用各种可能的药物去与靶分子作用,筛选出疗效最显著、毒性最小的药物。

目前对基因与疾病的关系了解甚少,传统的药物研究难以进行。一是很难将药物与靶子联系起来;二是可选择的靶分子数量有限,尤其有些靶分子难以分离或危险性大。如艾滋病病毒(HIV)的蛋白酶,在病毒颗粒中仅存在几分钟,含量极低,若用传统的药物筛选途径来分离此酶,则要求大量培养这种病毒,然后从中分离出致死病原性物质。

对中药产业来说,药物筛选的困难更加突出。首先中药作用机理目前还无法用现代医学知识来解释,在蛋白质水平和基因表达水平上缺乏可以量化的现代生物学指标。其次中药的组成成分非常复杂,各种成分含量又极少,用传统的整体动物试验和离体器官试验筛选有效成分的工作量非常大,难以得到理想药物。

生物芯片技术是解决药物筛选难题的一种非常有效的手段。利用基因芯片技术首先可以了解正常组织和疾病组织基因表达谱的差异,并与组织学与生物化学变化联系起来。因为基因表达的增加或降低可能就是病理生理学的原因或结果,引起疾病的多个基因产物可以作为药物作用的靶分子,通过使表达异常的基因恢复正常表达或使异常减轻,可以指导药物筛选。其次,通过分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达谱的变化,可以找出靶基因以及受到靶基因调控的基因,并能研究是否影响其他基因的表达而带来毒副作用。如果用mRNA反转录构建cDNA表达文库,再得到肽库制作肽芯片,则可以从众多的药物成分中筛选到有效成分。Jellis在寻找抗HIV的药物时,利用基因芯片技术筛选了654536种硫代磷酸八聚核苷酸,从中确定了对HIV感染有明显阻断作用的抑制剂。

用基因芯片技术进行药物筛选的基本方法可分为五步:①芯片的制备:根据表达谱数据库选择与疾病相关的基因制备药物筛选芯片;②作用模型的建立:可以构建细胞水平和整体水平的药物作用模型。细胞水平的模型可通过离体细胞培养法培养适当的人体细胞系,整体水平的模型可利用动物进行活体研究,但要注意动物和人类疾病之间的关系;③药物刺激和mRNA提取、标记:对刺激前的细胞和动物活体,分别提取mRNA,并用Cy3(一种荧光染料,发红光)标记,然后将适当剂量的药物加入细胞培养液中,以及用适当剂量的药物喂养动物,不同时间取样(或取动物适当的器官),提取mRNA,并用Cy5(一种荧光染料,发绿光)标记;④芯片杂交:将药物刺激前后的mRNA与药物筛选芯片进行杂交;⑤结果扫描、分析:用表达谱数据库及配套软件分析受药物诱导基因的表达情况,确定药物作用的靶基因和药物的疗效,流程见图1。

生物芯片技术用于新药的筛选,一是可以发现这种药物影响了哪些基因的表达,找出药物作用的靶基因,分析可能的作用机制,为其确切疗效找到基因调控机制的理论基础。还可分析该药物不希望出现的靶基因,确证是否可能引起毒副作用。二是以某一功能或数种功能调控机制为基础,进一步分析药物中起关键作用的组分,并通过有效组分的再组合,开发出升级换代的新药品。三是选用受影响的功能基因,鉴定和筛选对该药物无效或有副作用的病人,使其具有更强的针对性,为实现个性化治疗提供依据。生物芯片技术用于大规模药物筛选研究,可以省去大量的动物试验,大大缩短筛选时间,降低成本。目前美国很多制药公司已开始了前期工作,建立表达谱数据库,为药物筛选提供各种靶基因和分析手段。

2、在耐药性研究中的应用

耐药性又称抗药性,一般是指病原体对药物反应性降低的一种状态。细菌对抗菌药的耐药机制有很多种。一是产生灭活酶,如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等,这是最主要的一种机制;二是靶位改变,如青霉素结合蛋白(PBPS)改变等;三是细胞膜通透性改变,使药物不易进入细菌细胞内;四是泵出系统增强,使已进入细菌内的药物不断排出细胞外。另外还有胞膜主动转运减少、建立了新的代谢途径、拮抗物增加等。而且经常可由两种以上的机制产生。由于抗药性的产生,使得人类有时面对细菌的入侵束手无策,无药可用。1992年美国疾病控制中心(CDC)的资料表明,有13300例住院患者,由于细菌感染得不到控制而死亡。其中多重耐药菌(Multi-drugresistantbacteria,MDR),即细菌对三种以上不同种类的抗菌药物产生耐药性的细菌,对全球的感染情况不容乐观,尤其对婴幼儿、免疫缺陷者和老年人的威胁更加严重。所以MDR感染已成为临床治疗上的难点和抗菌药物研究领域的热点。要解决耐药性这个难题,首先,是要找到耐药菌的耐药基因;其次,要根据这些耐药基因,设计新型抗生素,或将耐药菌分型,然后在临床上针对不同的亚型,使用相应的抗生素来改善治疗效果。

国外已开始使用生物芯片技术来检测耐药菌基因的变异情况,即检测耐药基因。检测的方法,一是可以利用表达谱芯片检测药物诱导的基因表达变化来分析其耐药性;二是可利用寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点,从而分析其耐药性。如MichaelWilson等采用基因芯片技术检测到肺结核杆菌中脂肪酸合成酶Ⅱ、fbpC、efpA、fadE23、fadE24和ahpC基因发生了改变,这些改变与其耐药性有关。

用生物芯片技术可以同时检测耐药菌的多个耐药基因,还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。这样就能高效率地提供新药作用的靶分子,并能指导抑制靶分子的新药合成,对临床用药也有指导意义。

3、在个性化药物及治疗研究中的应用

个性化治疗要求在用药前必须对病人进行药物敏感性基因及其表达的检测,才能指导用药。这项工作可由基因芯片技术来完成。如目前用于治疗艾滋病的药物主要是HIV逆转录酶RT和蛋白酶PRO的抑制剂,但在用药过程中常出现耐药,Lipshutz等研究发现这主要是由于Rt基因和Pro基因产生一个或几个点突变造成。Rt基因常见的四个突变位点是:Asp67→Asn、Lys70→Arg、Thr215→Phe、Lys219→Glu,若这四个位点均发生突变,则耐药性会成百倍增加。如果在用药前将这些基因突变部位的序列构建成基因芯片,对患者进行快速检测,针对性就较强。

4、结语

生物芯片技术在药物筛选、耐药性研究、药物作用机制、基因药物设计、药物治疗过程中毒副反应预测、药物毒性评价,以及对中药真伪的快速鉴定和分析方面都具有良好的应用前景。目前开发和研制出的一些芯片,已推进了药物研究。如细胞色素P450芯片,可用于研究药物新陈代谢时基因的变化。药物控释芯片,能加载有效治疗药物,长时间地同时控制一种或多种不同药物的释放,成为体内药剂师,对治疗帕金森氏综合症或癌症很有意义。

以生物芯片技术作为突破点,将中药研究提升到蛋白质水平和基因表达水平,对中医药宝库进行大规模筛选,我国的中药新药开发就有很大的潜力。

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