带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。如带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。电泳技术是生物化学与分子生物学中的重要研究方法之一，利用电泳技术可分离许多生物物质，包括氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物质的纯度和分子量的测定等。

电泳的基本原理

许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动。由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。

一．泳动度

设一带电粒子在电场中所受的力为F，F的大小决定于粒子所带电荷Q和电场强度 E，即 ：F = E•Q

根据Stoke氏定律，一球形分子在非真空条件下（例如在溶液中）运动时所受的阻力（F′）与分子移动的速度（v），分子半径（r）、介质的粘度（η）有关，即：

F′ = 6πrηv

当F=F′时，即达到动态平衡时：

E•Q = 6πrηv

移项得 v/E = Q/ 6πrη （1）

v/E 表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率(mobility)，也称电泳速度，以μ表示，即：

μ = Q/ 6πrη （2）

由式（2）可见，带电颗粒的迁移率在电场中的泳动速度与本身所带净电荷的数量，颗粒大小、形状和介质的粘度等多种因素有关，一般说，所带的净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，则在电场中泳动速度愈快；反之则慢。两种不同的粒子一般有不同的迁移率，在具体实验中，移动速度v为单位时间t内移动的距离d，即：

v = d/t

又电场强度E为单位距离内电势差U(以伏特计)，L为支持物的有效长度，即：

E=U/L

以v=d/t，E=U/L代入（2）式即得：

μ = Q/ 6πrη = v/E = dL/tU

式中：v为粒子的泳动速度（厘米/秒或分），E为电场强度或电势梯度（伏/厘米），d为粒子泳动距离（厘米），L为支持物的有效长度（厘米），U为加在支持物两断的实际电压（伏），t为通电时间（秒或分）。故迁移率（或泳动度）的单位为厘米2·秒-1·伏特-1。

某物质（A）在电场中移动的距离为：

d A= μA tU/L

另物质（B）的移动距离为：

d B= μB tU/L

两物质移动距离差为：

d A- d B = (μA - μB)tU/L (3)

式(3)指出物质A、B能否分离决定于两者的迁移率。若它们的迁移率相同则不能分离，有差别才能分离，差别越大，分离越好。当然，也与其他实验条件有关。

二．影响电泳的因素

电泳结果可受到多种因素的影响，但通常认为以下4个方面更为重要。

（一）电场强度

电场强度和电泳速度成正比关系。电场强度越高，则带电粒子的移动越快。电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳，前者电场强度一般为2～10伏特/厘米，后者为20～200伏特/厘米。但电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性，必须有散热措施，才能得到好的效果。

（二）介质的pH值

介质的pH值决定了带电粒子解离的程度，也决定了该物质所带净电荷的性质和多少。对两性电介质如蛋白质，介质的pH离开等电点越远，所带净电荷越多，则泳动速度亦越快，反之越慢。若在等电点pH介质中，则不能移动。因此，当分离某一蛋白质混合物时，应选择一个合适pH值，使各种蛋白质所带的电荷量差别较大，以利于彼此分开。通常为保持介质pH的稳定性，电泳都在一定的缓冲液中进行。

（三）缓冲液的离子强度

缓冲液的离子强度低，电泳速度快，但分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。如果离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，难维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量使电泳速度过慢。所以最适离子强度一般在0.05～0.1mol/L 之间。

溶液离子强度的计算：

I= 0.5ΣCiZi2

式中：I为离子强度；Ci为离子的摩尔浓度；Zi为离子的价数；Σ表示"加和"的符号。

（四）电渗作用

在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗。如在纸电泳中，滤纸中含有表面带负电荷的羟基，因感应相吸而使与纸相接触的水溶液带正电荷，在电场中液体向负极移动，并带动着物质移动。由于电渗作用与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受到电渗影响，如果物质原来向负极移动，则移动更快，反之则慢，所以电泳时粒子表面速度是其本身泳动速度与由于电渗而被携带的移动速度两者的加和。例如，在pH8.6巴比妥缓冲液中进行血清蛋白纸电泳时，γ-球蛋白虽然也同其它主要血清蛋白质一样带有负电荷，应向正极移动，但它却向负极方向移动。这一结果是由电渗作用引起的。选择电泳支持物时，以电渗作用小或几乎无电渗作用的为宜。

三．电泳的分类

电泳可分为显微电泳，自由界面电泳和区带电泳三种，其中区带电泳操作简便，容易推广，因此常用于分离鉴定。区带电泳又称区域电泳，即电泳在不同的惰性支持物中进行，使各组分成带状区间。区带电泳的形式，仅按某一特点分类似乎都不全面。这里基于支持物的物理性状、装置形式、pH值的连续性等不同，可分为：

（一）按支持物物理性状

1． 滤纸及其它纤维素薄膜电泳 如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳。

2． 凝胶电泳 如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳，制成凝胶板或凝胶柱。

3． 粉末电泳 如纤维素、淀粉、琼脂粉等，将粉末与适当的溶剂调和，铺成平板。

4． 线丝电泳 如尼龙丝、人造丝电泳，是一类微量电泳。

（二）按支持物的装置形式

1． 平板式电泳 电泳支持物(如凝胶)制成水平板状。

2． 垂直板式电泳 板状支持物，在电泳时，按垂直方向进行。

3．连续—流动电泳 首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，缓冲液和样品自顶端下流，与电泳方向垂直。也可以用其它材料作支持物。该法主要用途是制备一定量的电泳纯物质。

4．圆盘电泳 电泳支持物灌制在两通的玻璃管中，被分离的物质在其中泳动后，区带呈圆盘状。

（三）按pH的连续性

1．连续pH电泳 电泳的全部过程中缓冲液pH保持不变。如纸电泳、醋酸纤维素膜电泳。

2．非连续pH电泳 缓冲液和支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、等速电泳等。

醋酸纤维素薄膜电泳

醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持物，它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。醋酸纤维素膜薄是一种细密而又薄的微孔膜。醋酸纤维素膜对样品的吸附性较小，因此，少量的样品，甚至大分子物质都能得以较高的分辨率。又由于醋酸纤维素薄膜亲水性较小，故电渗作用也较小，并且它所容纳的缓冲液也较少，因此电流的大部分由样品传导，可以加速样品分离，大大节约电泳时间。醋酸纤维素具有操作简单、快速、价廉、定量容易等优点，尤其较纸电泳分辨力强、区带清晰、灵敏度高和便于保存、照相等，目前醋酸纤维素薄膜电泳己取代纸电泳而被广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大地提高了分辨能力。琼脂糖系天然的琼脂加工制得，天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果，而加工制得的琼脂糖凝胶为支持物进行电泳可以克服琼脂不足之处，其优点如下：

1．琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。

2．琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99%），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

3．琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量测定。

4．电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。琼脂糖凝胶通常制成板状，常用1%琼脂糖作为电泳支持物。电泳缓冲液的pH在6～9之间，离子强度最适为0.02～0.05。离子强度过高时，将有大量电流通过凝胶，使凝胶中水份大量蒸发，甚至造成凝胶干裂，电泳中应加以避免。由于琼脂糖电泳具有较高分辨率、重复性好，区带易染色、洗脱和定量以及干膜可以长期保存等优点，所以常用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶等同工酶的分离和鉴定，为临床某些疾病的鉴别诊断提供了可靠的依据。与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术，用于分离和检测抗原。可对目前常用的琼脂糖进行某些修饰，如引入化学基团羟乙基，则可使琼脂糖在65℃左右便能熔化，被称为低熔点琼脂糖。该温度低于DNA的熔点，而且凝胶强度又无明显改变。以此为支持物进行电泳，称为低熔点琼脂糖凝胶电泳，主要应用于DNA研究。如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等，为DNA分子及其片段分子量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂又称为共聚体的N,N’-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。

一．聚丙烯酰胺凝胶所具有的优点：

1．机械强度好，弹性好，透明，无电渗作用，吸附作用极小。

2．化学性能稳定，与待分离物质不起任何化学反应。

3．样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。

4．凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。

5．分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为圆盘电泳、垂直板型电泳、梯度凝胶电泳、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及双向电泳等技术。盘状电泳是在垂直的玻璃管内，利用不连续的缓冲液、pH和凝胶孔径进行电泳而命名的。垂直板型电泳是将聚丙烯酰胺凝胶聚合成薄板状凝胶，竖直进行电泳，其优点是：在同一条件下可电泳多个要比较的样品，重复性好。在聚丙烯酰胺凝胶体系中加入十二烷基硫酸钠（SDS），SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷，从而消除和遮盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，因此它与蛋白质结合后，还可引起蛋白质构,[象的改变。基于此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关，可用于蛋白质分子量的测定。

二．凝胶的制备

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成，Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在游离基存在时，它们就聚合成凝胶。引发产生游离基的方法有化学法和光学法两种。

1．化学聚合

常用的催化剂系统有：

（1）过硫酸胺——TEMED(四甲基乙二胺)；

（2）过硫酸胺——DMPN(二甲基氨基丙腈)；

（3）过硫酸胺——三乙醇胺。

上述皆为催化氧化还原体系，称为化学聚合。其中过硫酸胺产生游离氧原子，使单体成为具有游离基状态，从而发生聚合。TEMED，DMPN和三乙醇胺的作用是加速剂。分子氧阻止聚合，冷却也可使聚合速度变慢。对这些因素加以控制，聚合一般在1小时以内可以完成。

2．光聚合

光敏物质核黄素代替过硫酸铵作催化剂。核黄素经强光照射后引发自由基，后者使Acr形成自由基并聚合成凝胶。TEMED并非必需，但加入可加速聚合。

三．凝胶孔径的调节

凝胶孔径、机械性能(弹性)、透明度等在很大程度上取决于Acr和Bis二者的总浓度T%。T%越大，孔径越小，机械强度则增加。凝胶的特性是分子筛效应。在聚合前调节单体的浓度来控制凝胶孔径大小，有利于针对样品分子大小，增加分辨力。为此可以根据分离样品分子大小配制不同孔径的凝胶。一般大孔胶易碎，小孔胶难以取出。另外考虑选择适宜的缓冲液。缓冲液的作用一是用来维持容器内和凝胶外的pH恒定，二是作为在电场中传导电流的电解质。要使缓冲液很好地完成这些作用，必须注意三个条件：第一，缓冲液不与被分离的物质相互作用；第二，缓冲液pH值不能使蛋白质变性，对于分离蛋白质的最大pH限度通常是pH4.5～9.0；最后还要考虑到缓冲液的离子强度。

四．分离蛋白的基本原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大类，前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因此具有很高的分辩率。

不连续体系由电极缓冲液、样品胶、浓缩胶及分离胶所组成，它们在直立的玻璃管（或2层玻璃板中）排列顺序依次为上层样品胶、中间浓缩胶、下层分离胶。样品胶是核黄素催化聚合而成的大孔胶，其作用是防止对流，促使样品浓缩以免被电极缓冲液稀释。目前，一般不用样品胶，直接在样品液中加入等体积40%的蔗糖，同样具有防止对流及样品被稀释的作用。实际上，浓缩胶胶的延续，凝胶浓度及值与样品胶完全相同，其作用是使样品进入分离胶前，被浓缩成窄的扁盘，从而提高分离效果。分离胶是由过硫酸铵催化聚合而成的小孔胶，主要起分子筛作用。在此电泳体系中，有2种孔径的凝胶、2种缓冲液体系、3种pH值，因而形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。PAGE具有较高的分辨率，就是因为在电泳体系中集样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应为一体。下面就这3种物理效应的原理，分别加以说明。

1．样品的浓缩效应

不连续电泳一般含有3种性质不完全一样的凝胶，其组成如下：

（1）凝胶孔径不连续性 在上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 该系统的电极缓冲液是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，样品胶和浓缩胶是用pH6.7的Tris-HCl缓冲液制成的，电泳时，HCl在任何pH溶液中均易解离出Mg²⁺,它在电场中迁移率快，走在最前面称为前导离子或快离子。在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨酸，它在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出NH₂CH₂COO-，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中解离度最小，在电场中的迁移率很慢，称为尾随离子或慢离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动，其有效迁移率介于快离子和慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此，Mg²⁺及NH₂CH₂COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多个区带。电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中的氯离子（快离子）有效泳动率超过蛋白质的有效泳动率，很快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而G1y-成为慢离子，在最后面。快离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区，即低导区，电势梯度增大。因此，低导电压区就有较高的电势梯度，这种高电势又迫使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进，追赶快离子。夹在快、慢离子间的蛋白质样品就在这个追赶过程中被逐渐地压缩聚集成一条狭窄的起始区带。

2．分子筛效应：

分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应。颗位小，形状为园球形的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，颗粒大，形状不规则的样品分子，通过凝胶的阻力较大，移动慢。

3．电荷效应

当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离，并以一定的顺序排列成一个一个圆盘状。

等电聚焦电泳

等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的电泳介质来分离等电点(pI)不同的蛋白质的电泳技术。这是六十年代后期才发展起来的新技术，基本原理是在制备聚丙烯胺胶凝胶时，在胶的混合液中加入载体两性电解质(商品名Ampholine)。这种载体两性电解质是一系列含有不同比例氨基及羧基的氨羧酸混合物，其分子量在300～1000范围内，它们在pH2.5～11.0之间具有依次递变但相距很近的等电点，并且在水溶液中能够充分溶解。含有载体两性电解质的凝胶，当通以直流电时，载体两性电解质即形成一个从正极到负极连续增加的pH梯度。如果把蛋白质加人此体系中进行电泳时，不同的蛋白质即移动并聚焦于相当其等电点的位置。好的载体两性电解质应具有以下特点：在等电点处有足够的缓冲能力，不易被样品等改变其pH梯度；必须有均匀的足够高的电导，以便使一定的电流通过；分子量不宜太大，便于快速形成梯度并从被分离的高分子物质中除去；不与被分离物质发生化学反应或使之变性等。Ampholine是一种常用的载体两性电解质。要取得满意的等电聚焦电泳分离结果，除有好的载体两性电解质外，还应有抗对流的措施，使已分离的蛋白质区带不致发生再混合。要消除这种现象，办法之一加入抗对流介质，用得最多的抗对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。

等电聚焦电泳与其它区带电泳比较具有更高的分辨率，等电点仅差0.01pH的物质即可分开；具有更好的浓缩效应，很稀的样品也可进行分离，并且可直接测出蛋白质的等电点。所以此技术在高分子物质的分离、提纯和鉴定中的应用日益广泛。但是等电聚焦电泳技术要求有稳定的pH梯度和使用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质易发生沉淀。