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一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。 二、实验步骤： 1. 样品的溶解 取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液（1mg蛋白：100ul裂解液）振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80℃保存。 2. Bradford法测蛋白含量 取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解，测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。 取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul，5ul，10ul，15ul，20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为80ul），然后，各管中分别加入4ml的Bradford液（原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。（测量过程要在一个小时内完成）。 3. 双向电泳第一向——IEF（双向电泳中一律使用超纯水） 3.1 水化液的制备 称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后，加入8ul 0.05% 的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer （pH 3-10）振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。 在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合，13200rpm离心15min除杂质，取上清。 3.2 点样，上胶 分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels （18cm，pH 3-10）胶条，从正极到负极将胶条压入槽中，胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油（Bio-Rad），两个上样槽必须与底线齐平。 3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20℃） S1 （30v, 12hr, 360vhs, step） S2 （500v, 1hr, 500vhs, step） S3 （1000v, 1hr, 1000vhs, step） S4 （8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad） S5 （8000v, 5hr, 40000vhs, step） 共计44110vhs, 19.5小时 其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦 3.4 平衡 用镊子夹出胶条，超纯水冲洗后，在滤纸上吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A,平衡液B先后平衡15min. 注：平衡时要注意保持胶面始终向上，不能接触平衡管壁。 平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker,转入SDS-PAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml. 4. 双向电泳第二向——SDS-PAGE 4.1 配胶（两根胶条所用剂量） 分离胶：（T=8% 80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED 30 % 丙烯酰胺储液 21.28ml 分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul 双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8% 10ml） 30 % 丙烯酰胺储液 1.6ml 浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul 双蒸水 5.9ml 4.2 灌胶 将玻璃板洗净后，室温晾干，然后，将电泳槽平衡好，玻璃板夹好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶，倒入正丁醇压胶，凝胶后（这时会出现三条线），用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再用滤纸除水后，倒入浓缩胶，正丁醇压胶，凝胶后，用注射器吸去正丁醇，超纯水洗两次，再加入超纯水，用保险膜封好。 |
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4.3 转移 剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDS-PAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上，加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上（琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好，水浴加热溶解，并保持烧杯中水处于沸腾状态，至用之前再拿出来），再将IPG胶条缓缓加入SDS-PAGE胶面，其中不断补加5%的琼脂糖溶液，注意不能产生气泡。 4.4 跑胶 浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时 5. 银染（两根胶条所用剂量）（银染特别注意用超纯水） 5.1 固定 30min 无水乙醇 200ml+乙酸50ml,用超纯水定容至500ml 5.2 敏化 30min 无水乙醇 150ml Na2S2O3·5H2O 1.5688g 无水乙酸钠 34g 先用水溶解Na2S2O3·5H2O和乙酸钠，再加乙醇，最后定容至500ml 5.3 洗涤 5min × 3次 5.4 银染 20min AgNO3 1.25g 用超纯水定容至500ml 5.5 洗涤 1min × 2次 5.6 显影 无水Na2CO3 12.5g 用超纯水定容至500ml 甲醛（37%）0.1ml，临时加 5.7 终止 10min EDTA-Na2?2H2O 7.3g 用超纯水定容至500ml 5.8 洗涤 5min × 3次 注：整个双向电泳实验中全部使用超纯水，尽量减少离子的影响。 |
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实验相关试剂配制 1.Bradford 工作液 95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250,溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml.过滤后置于棕色瓶 考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效） 2.裂解液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% DTT 60 mM Tris-base 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate） 3. 水化液储液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4% Tris-base 40 mM 4. 分离胶buffer （pH8.8） 250ml SDS 0.4% 1g Tris-HCl 1.5M 45.4275g 5. 浓缩胶buffer （pH6.8） 100ml |
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SDS 0.4% 0.4g Tris-HCl 0.5M 6.07g 6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺） 250ml Acr 29.2% 73g Bis 0.8% 2g 7. 电极缓冲液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g SDS 3g 2.5g 超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml 8. 0.5M Tris -HCl pH 6.8储液 6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml,3M HCl调pH6.8,再加水定容至100ml 9.平衡液储液 脲（即尿素） 36g 甘油 30% 30ml SDS 1% 1g 0.5M Tris-HCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml 10. 平衡液A（一根胶条） DTT 20mg 平衡液储液 10ml 11.平衡液B（一根胶条） 碘乙酰氨 300mg 平衡液储液 10ml 0.05%溴酚兰 15ul （平衡液A、B均需临时配制） 12.0.5%琼脂糖10ml 琼脂糖 0.05g 电极缓冲液 10ml 溴酚兰 25ul 补：4、5、6的溶液需过滤后储存于4℃备用。 |
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