若表现蛋白质上含有一段六个His 的片段,而亲和吸着剂胶体上接有镍离子,此蛋白质会专一性地结合到吸着胶体;洗去杂质后可用imidazole 溶离纯质蛋白质(Pharmacia 操作手册, Affinity Chromatography)。 仪器设备: 亲和层析管柱 (Bio-Rad 731-1550 Poly-Prep column, 0.8×4 cm) 分划收集器 (另需准备干净试管约25 支) 药品试剂: 金属螯合亲和层析胶体 (Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210) 1 mL ◆ 在洋菜胶粒上接有nitrilotriacetic acid (NTA) 官能基,可以螯合镍离子;使用前先以镍离子饱和的。 Buffer B-300/0 (50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl) ◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol. Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole 方法步骤: 1) 亲和层析胶体1 mL 已经装填在管柱内,成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上,去除下方的填塞物,用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口,准备注入样本。 2) 除去胶面上方的缓冲液,并取出样本 (IEX) 使其回到室温,慢慢用滴管加到亲和胶体上,小心勿弄乱胶体表面;让样本没入胶体中,同时收集流出液每管2.5 mL. 3) 待样本全部进入胶体后,关闭出口,再慢慢加入buffer B-300/20,打开出口收集流出液;buffer B-300/20 共流洗30 mL. 4) 接着以buffer B-300/250 流洗30 mL,方法同上,收集各分划。 5) 所有分划均定量蛋白质并测定酶活性,收集酶活性最高的数个分划,共得 _______ mL (AF),保留100 μL 以供分析。 |
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