原理:这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。 溶液: 1)Bradford储存液 100ml95%乙醇 200ml88%磷酸 350mgServaG蓝 室温下长期保持稳定。 2)Bradford工作液 425ml双蒸水 15ml95%乙醇 30ml88%磷酸 30ml Bradford储存液 用滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,可保存数周,但在使用前需要过滤。 3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA) 做标准曲线: 取样品即可测量。 注意事项: 1、样品制备,样品制备是做好2-d 的关键,样品中离子浓度不能过大,最好用新鲜的样品提取蛋白质,如果不确定蛋白提取情况,建议先跑sds-page检验。 2、上样量的问题, ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖。 3、ipg 胶条ph 的选择,根据不同样品选择不同pH值。 4、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度需调整。 |
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