1、反应体系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H₂O 5.5 ul cDNA 5 ul

2、Primer 浓度，需要摸索，从200nM到700nm等，设置不同浓度。

3、每个引物浓度，从well 1到12设置4个样本，阳性cDNA 1和2，NTC以及H2O，做triplicate。

4、若用ABI7000或7700，所有的PCR条件可设置成一致的，减少麻烦，当然，引物设计时就要考虑好，第一步除UNG，然后预变性，然后PCR循环，ABI采用二步法，退火延伸均60度，循环最多40。

5、结果分析: 阳性1，2曲线，NTC的Ct值需大于阳性Ct值至少5到6个循环以上，H2O基本Ct值接近40。

6、做Dissociation Curve，若好的引物，可见单一峰，若见两个峰，则他们的温度差值需在2度以上。

7、AGAROSE凝胶电泳证实，目的基因的长度，是否单一条带，有无杂带，和第6步的结果对照，引物二聚体的量，基因组DNA有无扩增。

8、选择合适的引物浓度。

9、必须考虑cDNA的含量，有时所检测基因表达非常低。

一般按上述步骤，都能做出，问题通常在于: 你的cDNA质量，所用试剂的质量（建议用进口，既然走到这一步，就省不了了），引物设计是否合理（序列，Tm值接近50或60度等）。

10、即便能所用引物能获得扩增，但是并不能证明就能使用，如果采用相对法比较，还要做efficiency curve，此法假定的E值是2，也就是说你的标准曲线斜率需要达到-3.3左右，但是实际并不一定如此。若扩增效率和内参不同，那只有重新设计引物，或者采用标准曲线法。

REAL BORING PCR，看来还是需要做许多工作的。

实在不行，如果有MONEY，那就用TAQMAN，买ABI的KIT，那些公司都优化好的，基本可以直接使用，何况SYBR GREEN I的特异性不如TAQMAN，而且如果摸了无数次都不能获得良好的结果，那些花掉的MONEY还不如买现成的，即省钱省时省力，不过就是丧失了从不断的失败痛苦中寻找成功的喜悦了。