从总RNA中分离mRNA

采用Promega公司的PolyATract® mRNA Isolation System III。
 
使用该试剂盒，mRNA产量极低，因此下述方法是以Promega公司试剂盒操作手册为基础，并采用储昭晖硕士(作物遗传改良国家重点实验室植物分子生物学水稻分室)所建议的改进方法综合而成。

由使用者自备的材料

65℃水浴
　　无菌的、无RNase的1.5ml塑料离心管
　　f无菌的、无RNase的加样枪和枪头

操作步骤

1.探针的退火

1）在一个无菌的、无RNase的离心管中，加入未稀释的总RNA溶液，使终体积达到1.5ml。可使用更大量的总RNA，其浓度可至过饱和，即有絮状RNA沉淀析出，但当有絮状RNA沉淀存在时，后续的退火反应操作会受到一定程度影响；也可使用更少量的总RNA(50ug)，但mRNA产量可能无法保证。

2）将离心管置于65℃水浴中10分钟或略长时间。

3）加入15ul 的Biotinylated-Oligo(dT)探针和39ul的20×SSC到RNA中。颠倒数次以混匀，静置于室温下至充分冷却。这将需要10分钟或略少的时间。在该溶液冷却期间，制备0.5×和0.1×SSC贮存液

2.贮存液制备

1）通过在三个无菌的、无RNase的离心管中各自混合30ul的20×SSC和1.170ml的无RNase的水来制备三份1.2ml的无菌的0.5×SSC。

2)通过在三个无菌的、无RNase的离心管中各自混合7ul的20×SSC和1.393ml的无RNase的水来制备三份1.4ml的无菌的0.1×SSC。

3.链霉抗生物素蛋白-磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles)的漂洗

1）取三管链霉抗生物素蛋白-磁珠，轻弹离心管的底部使SA-PMPs重悬直至其充分分散，吸取悬液合并于一管。

2）使汇总的SA-PMPs重悬直至其充分分散，然后将离心管置于磁柱中直至SA-PMPs已经聚集在离心管壁上(大约30秒)。小心地移出上清。不要离心沉淀颗粒。

3)用0.5×SSC漂洗SA-PMPs三次(每次0.9ml)，每次都使用磁柱来捕获它们，然后小心地移去上清。

4)重悬漂洗过的SA-PMPs于0.3ml的0.5×SSC中。

4.Oligo(dT)-mRNA退火杂合体的捕获和漂洗

1）将退火反应的全部成分加入到含有漂洗过的SA-PMPs的离心管中。

2）室温下静置10分钟。每1-2分钟轻柔地颠倒一次以混匀。

3）用磁柱捕获SA-PMPs，小心移去上清，注意不要搅动SA-PMPs颗粒。当总RNA为过饱和高浓度时溶液时，退火反应易形成黑色絮状物，磁柱吸附也难以压缩其体积，这时应小心吸取上清；保留上清直至确信mRNA的结合与洗脱已是令人满意。

4）用0.1×SSC(每次0.9ml)漂洗颗粒4次，其间轻弹离心管底部直至颗粒已被重悬。最后一次漂洗后，在不搅动SA-PMPs的前提下，以8000rpm离心1分钟，尽可能多地移出液相。

5.mRNA的洗脱 

1）为洗脱mRNA，将最终的SA-PMPs重悬于0.1ml的无RNase的水中，温柔地轻弹离心管以重悬颗粒。

2）65℃水浴2分钟。

3）用磁场捕获SA-PMPs，8000rpm离心30秒。

4）将含有洗脱的mRNA的液相移入一无菌的、无RNase的离心管中。勿将颗粒丢弃。

5）重悬SA-PMP颗粒于0.15ml的无RNase的水中，65℃水浴2分钟，用磁场捕获SA-PMPs，8000rpm离心2分钟。将洗脱液与5. 4)步骤中洗脱的mRNA合并。
6）如果这时有任何颗粒也被携带到终溶液中，可用10,000×g，4℃，5-10分钟的离心来去除。小心地将RNA转入一新鲜的无RNase的离心管中。

6.mRNA的浓缩

1）加入等体积异丙醇，混匀。通常立刻有肉眼可见之沉淀生成，立即以12000rpm离心10分钟，沉淀mRNA。或根据沉淀生成的难易，-20℃放置数小时或过夜再沉淀。

2）小心倒去异丙醇，加75%乙醇洗涤。

3）小心倒去75%乙醇，室温干燥。

4）将mRNA溶于20ul无RNase的水中。注意管壁上通常会粘附大量mRNA沉淀，用枪头吸取水滴在管壁上滚动数次以尽可能回收mRNA。