5）为了在SG反应后作溶解曲线，引入与溶解曲线起始温度点相同的保温步骤（大约60秒），这样可以确保溶解温度起始于一个确定的温度。

6）溶解曲线分析可以重复。可以在相当一段时间内重新作溶解曲线，甚至到第二天也可以。

7）关于可以用SG检测的引物对的列表，请查询 www.realtimeprimers.org

8） 进行SG分析的典型程序是什么？

变性：检查反应所用的酶（2min，5min，10min或15min）
循环：95度/20秒，退火温度/20秒，72度/20秒
保温：72度/60秒
溶解：72-99度，on Melt A

要获得更多的细节请参考3.1.4

9）在哪个通道SG可以被检测？

双通道机型/多通道机型：
发射：：470nm
检测：510nm

多通道机型：
发射：470nm
检测：585nm

10）SG的稳定性如何？

只要不进行稀释，SG是非常稳定的。一旦稀释，可以保存1周到3个月，这取决于冻融次数，推荐配置成一定浓度的贮存液，用时现用现配稀释液。

11）随着mRNA和随后得到的cDNA和DNA的数量和质量的提高，检测到低拷贝数的能力会增强。用到的引物浓度通常是50nM到300nM。

12）利用SG作溶解曲线分析的结果会因以下的因素而有所差别：a）产物的大小 b）产物的GC含量。由于以上的因素单核苷酸多态性（SNP）有可能检测不到。

13）推荐用HPLC纯化引物。虽然对于复制子的扩增没有太大影响，对NTC可能会有很大影响。

14）尽管更长的扩增子也能进行反应，最适的扩增子长度应该是100-200bp。

15）由于很多因素的影响扩增子的溶解温度会有一定变异。溶解温度会受特殊缓冲液的pH值，所用Taq聚合酶，SG和MgCl₂浓度和其他因素的影响。要做溶解曲线的对比你首先要确保所用的条件相同。

16）使用SG的一个主要不利因素是引物二聚体的非特异扩增。我们最近利用Qiagen的QuantiTectTM SYBRR Green PCR试剂盒得出相当好的结果。重复试验的结果非常接近，NTC根本没有出现扩增。这个试剂盒对于利用SG扩增低拷贝数的模板非常有用。

3.2 双标记探针

双标记探针的优化比SG优化容易。最重要的事情，也就是需要优化的是引物/探针浓度和它们的比例。最适的MgCl2浓度通常是4-5mM （终浓度），然而商业上可买到的Master Mixes用到7.5mM （终浓度）。

荧光探针的设计直接关系到实时监测的成败。下面的规则总结了设计引物和双标记探针应该考虑的一些建议。

a） 针对双标记探针的引物和探针设计的规则

所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基更稳定，那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。我们推荐可以去网址进行二级结构的检测，www.bioinfo.math.rpi.edu/mfold/dna/forml.cgi，进行前后验证。如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中，我们要进行BLAST和类似的分析，以确保特异性。

通用原则

1、先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。

2、扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性

3、保持GC含量在20%和80%之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。

4、为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

5、将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

b）探针设计指导

1、在设计引物之前设计探针

2、探针的Tm值应在68-70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。

3、探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在

4、选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

6、探针应尽可能的短，不要超过30个bp。

7、检测探针的DNA折叠和二级结构。

c）引物设计指导

1、引物的Tm值应在58-60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性最高。

2、引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

3、将引物尽量接近于探针

d）循环参数

当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后（根据Tag酶要求设定），反应要经过95℃，15-20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。

e）怎么优化探针和引物的浓度

对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得最低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有最高的增长。

引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度 组合的结果

探针浓度应该在50-250nM范围内优化

探针的浓度应该从（50，100，250nM）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在Rotor-Gene上进行试验，选择最小CT值和最高反应扩增的曲线做后续试验。

g） 进一步的提示

通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找最佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。

由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。

引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。

可以从以下网站获得探针，引物设计软件。

www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3

Primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的G，所以我们将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8-10度。

f）定量数据的分析

分析定量数据主要有两种基本的方法

i）绝对定量

ii）相对定量

研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据

h） 绝对定量

绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的

DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

在Rotro-Gene 上可以用几种方法来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，R值，反应 效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整， （或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个 标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道 内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使 用者。

ii）相对定量

相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的方法叫“比较CT值法（ㄓㄓCt）这种方法可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（norm alizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种方法成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的方法就是看ㄓCt（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ㄓCt 将是一条水平线（斜率< 0.01）。这意味着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定（1）目的基因使用最小和最大的浓度其结果都是准确的（2）两个基因的最小和最大的定量比值都是准确的）

将目的基因和内参照在不同的管中扩增使用标准曲线法是最少需要优化得。

使用比较CT法的优点就是可以不需要标准曲线。也可以排除在创造标准曲线时因为稀释误差而引起得副作用。只要目的基因及参照物有着类似得动态范围，则比较CT值法是最有效的方法。我们希望校正物比目的基因有较高得表达水平（较低的CT值），定量得计算就是获得目的基因和校正物间的CT值差别（ㄓCt）开始得。

ㄓCt=Ct（目的基因）-Ct（校正物）

对每一个要被定量的样品，这个值都被计算（如果目的基因值比校正物值高，则是正值，而如果是个负值也是可以得）应该选择一个样品作为参照（基线），这样其他样品都与其相比较。相比较的ㄓㄓCt包括了每个样品间ㄓCt值的差异，及与基线相比较的差值。如果基线代表了最小的表达水平，则ㄓㄓCt应该是负值，因为基线样品的ㄓCt是最大的，因为它有最大的CT值。如果有些样品的表达水平是升高，而另一些下降，则ㄓㄓCt是个负值和正值得混合。定量的最后一步就是将这些值转换成绝对量，相对表达量的公式是2-ㄓㄓCt

h）使用双标记探针进行多重反应

我们可以在ROTOR-GENE上进行多重反应，因为它可以检测多种荧光。一个管内最多可以检 测4种荧光，在ROTOR-GENE上可是使用FAM，JOE ，ROX CY5（想要进一步了解荧光素，可以去 看FAQ）

最常用到的多重扩增反应是对基因表达的定量。一个标记FAM的探针来检测看家基因，而用 别的的荧光素标记来检测同一个反应管中的另外1，2，甚至3个不同基因，在一个管中进行 四重反应，不仅可以降低反应成本，同时也可以降低对将样品分装到2至4个管中时加样准性的依赖。

为了进行一个多重反应，要确保一个目的基因的扩增不会影响另一个。一个目的基因的主导性会降低另一个相对量少的目的基因得扩增效率。这可能会导致不正确的结果，甚至会完全抑制了对相对量少的目的基因的检测。

为了决定引物限制浓度，应该使用终浓度20Nm到100nM之间进行几个反应，这样做得目的在于不影响CT值的前提下，尽量降低背景之上荧光值的增长。

使用双标记探针的扩增反应的Mg离子浓度要比一般反应中的高，因为Tag酶得5’-3’外切 酶的作用需要较高得Mg离子浓度。由于双标记探针需要5’-3’酶活性，必须要高Mg离子浓度（最少3.5nM，一般5nM）

i） 使用双标记探针进行突变检测

为了检测突变体，要设计两种不同颜色的探针。一个探针设计来检测野生型，可以标记FA

M，同时设计另一个标记JOE的探针来检测突变体。通常两个探针的差别只有1个bp，由于两 个探针相差极小，因此推荐使用严格的反应条件。

选择“analyse”和”Allelic discrimination”来分析数据，两个通道的结果会呈现在一个屏幕中，没有标记物的曲线是CH1结果，有循环数的是CH2，最多可以有四个探针（两个突 变体）可以被分析，在编辑好基因型名称，将域值调整到0以上后，结果就会在图下方的表格中显示出来。

j） RT－扩增

有一些扩增反应在ROTOT-GENE上进行反应之前，有一个RT步骤，SG和双标记探针都可以完 成。最近有一篇综述“Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays”，可以去johurnals.endocrinology.org/jme/025/jme0250169.htm

k） 看家基因

由于DAN/RNA量不同，基因表达的定量分析都要与一个初始参照基因想比较。对于RNA的量，由于组织，细胞数目，试验步骤，或RNA抽提效率的不同，会有很大的波动，下面一篇文 章就很好的告诉你，你的看家基因是否适合你的需要。

Schmittgen TD， Zakrajsek BA . Effect of experiment treatment an housekeeping gene expression validation by real-time quantitative RT-PCR. J Biochem Biophys Methods 2000NOV 20：46（1-2）：69-81

这里还有一些经常被使用的看家基因：beta-actin， GAPDH， cyclophilin，18sr RNA ，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthine ribosyl transferase，transferring receptor 及另外一些。要注意看家基因可以被反应调节所影响 ，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必须得。

l） 一些关于储存的建议

双标记探针可以保存在-80℃至少一年，在使用前将干粉稀释成已知浓度的储存液， 然后 分装在-20℃度保存。取出所需要的微量管中的探针溶解，放在冰上，直到使用时再打开 。如果每天都使用，则探针储存液应该用HPLC水稀释到一个恰当的浓度，TE 溶液，10m M Tris（ph7.5）.如果想长期保存探针，可以在稀释液中加入0，01%Tween 20和0.01%Gelatin。这样保存的探针可以一年或更长时间内不会降解。为了确保光学活性和最大反应果， 荧光探针都要避光保存。