关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，至今还没有可靠的规律。虽然我们可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但这个过程十分耗时且昂贵，不推荐常规实验使用。一种做法是每个目标序列设计3-4对siRNAs，实验选择较有效的siRNA。

方法一、根据Tuschl的实验的设计要点

目前，siRNA设计大都根据Tuschl的实验，要点如下：

1.目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA）。 设计siRNA时不要针对5' 和3' 端的非编码区。

2.分析获得的序列，选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。

3.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。

4.如果您选择shRNA，有报道显示9个寡核苷酸的环是最有效的。

方法二：

1.  从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3' 端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5' 和3' 端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2.  将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

3.  选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

负对照

一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3'dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。