采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：

1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；

2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；

3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。

一、 材料、试剂和仪器

1 材料：质粒DNA

2 试剂：限制性内切酶、ddH2O

3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅， 电泳仪，紫外透射观测仪

实验程序：

I  单酶切：
      II  双酶切：

注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。

二、 结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。

图 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析

M1 ： λ DNA/ HindIII M2：DL2000 1 - 6: 重组质粒HindIII XbaI

重组质粒用HindIII XbaI双酶切后释放出插入片断，因此空载体处于同一水平位置，而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。