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DNA酶切实验(图)

标签: DNA 酶切

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采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单,但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同,这时可以采用如下措施解决:

1)先用一种酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切;

2)先进行低盐要求的酶酶切,然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求,加入第二种酶进行酶切;

3)使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行,尽量避免星号活力。

一、 材料、试剂和仪器

1 材料:质粒DNA

2 试剂:限制性内切酶、ddH2O

3 仪器:微量移液枪,离心机,水浴锅, 电泳仪,紫外透射观测仪

实验程序:

I  单酶切:
      II  双酶切:

 

注:酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系,这样抑制因素得以稀释;基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大,一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10,否则甘油浓度会超过5%,会产生星号活力;对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活,乙醇沉淀,酚/氯仿抽提,添加EDTA或SDS等方法,具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活,这一点需要注意。

二、 结果与分析

假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底,紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样(超螺旋、线性和开环三条带),则说明质粒完全没有被切开。

图 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析

M1 : λ DNA/ HindIII M2:DL2000 1 - 6: 重组质粒HindIII XbaI

重组质粒用HindIII XbaI双酶切后释放出插入片断,因此空载体处于同一水平位置,而插入片断长度分别为0.8 ,2.1 ,1.6 ,1.2 ,0.7和 0.3kb。

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