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聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

标签: 聚合酶链式反应 PCR RT-PCR

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  PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍(图4),这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
  一、 PCR反应中的主要成份
  1. 引物:PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:(1) 引物长度约为16-30bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。 (9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
  2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP):dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
  3. Mg2+:Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
  4. 模板:PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
  5. Taq DNA聚合酶:一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有:(1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
  6. 反应缓冲液:反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris•Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . Tris•Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
  二、PCR反应参数
  1. 变性:在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
  2. 退火:引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成,引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。
  3. 延伸:延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
  4. 循环次数: 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。
  扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C=C0 (1+P)n 。其中:C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。
  在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应, 减少非特异性产物。
  三、PCR产物的克隆
  在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。
  1. 平末端连接:由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。
  2. 在PCR产物尾部加dT或ddT:Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。
  3. 粘性末端连接:利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。

目录

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材料、设备及试剂编辑本段回目录


  一、材料
  不同来源的模板DNA。
  二、设备
  移液器及吸头,硅烷化的PCR小管,DNA扩增仪(PE公司),琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪),台式高速离心机。
  三、试剂:
  1、10×PCR反应缓冲液:500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris•Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。
  2、MgCl2 :25mmol/L。
  3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。
  4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
  5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液:配方见第五章。
  6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。
  7、其它试剂:矿物油(石蜡油),1% 琼脂糖,5×TBE,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇和70% 乙醇。

操作步骤编辑本段回目录


  一、PCR反应
  1. 依次混匀下列试剂
   35μl H2 O
   5μl 10×PCR反应缓冲液
   4μl 25mmol/L MgCl2
   4μl 4种dNTP
   0.5μl 上游引物(引物1)
   0.5μl 下游引物(引物2)
   0.5μl 模板DNA(约1ng)
  混匀后离心5秒。
  2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
  3. 用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
  二、电泳
  按第二章所述,取10μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
  三、PCR产物的纯化
  扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端连接,往往需要将产物纯化。
  (一)酚/氯仿法
  1.取反应产物加100μl TE.。
  2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。
  3.再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。
  4.在水相中加300μl 95%乙醇,置-20℃下30min沉淀。
  5.在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH2O 中,待用。
  (二)Wizard PCR DNA纯化系统
  Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA,提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。
  该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化,试剂包括:
   50ml Wizard PCR DNA纯化树脂
   5ml 直接提取缓冲液
   50支 Wizard微型柱
  1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。
  2、加100ml直接提取缓冲液,涡旋混匀。
  3、加1ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合3次。
  4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
  5、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 80%异丙 醇,对微型柱进行清洗。
  6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g离心20秒,以除去微型柱中的洗液。
  7、将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50μl TE或水,静止1分钟后,12000g离心20秒。
  8、丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化DNA,存放于4℃或-20℃。
  [注意] 1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。
      2、PCR产物中矿物油应尽量吸去,否则会影响提取DNA的 产量。
  四、载体加dT尾
  1.将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
  2.在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。
  3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。
  4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
  5.加入2倍体积 95%乙醇,在-20℃下沉淀1hr。
  6、离心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10ml ddH2O中。
  五、PCR产物与载体粘末端连接
  1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。
  2、加1ml T4DNA连接酶,1ml 10×连接缓中液,混匀,16℃连接过夜。
  3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
  六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
  1. 在50ml的PCR产物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。
  2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。
  3. 用酚:氯仿抽提2次。
  4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7ml ddH2O中。
  5. 质粒用Smal 切开后,70℃ 15分钟灭活酶,取1ml (约0.1mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ,连接缓冲液1ml 。
  6. 取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
  [注意]1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
     2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
     3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
     4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。

实验:PCR产物的TA克隆编辑本段回目录

实验目的:掌握通过TA连接克隆PCR产物的原理和方法。
实验原理:通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中,由于往往不清楚目的基因的DNA序列,获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法,重组到T-载体中,通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中,使用的DNA聚合酶不同,往往分为2种情况:(1)使用不同的Taq酶,在PCR扩增循环结束后,加上72℃ 10分钟一个过程,Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A,因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。(2)使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,由于其不能在扩增产物的3末端加上A,得到的DNA序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加A的过程,通常是以PCR回收产物为模板,加上一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP(或dNTP), 72℃ 10分钟,然后将加A产物直接用于TA连接。以T载体为例,pMD 18-T Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。它是TaKaRa独自研究开发,由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点,用EcoR V 进行酶切反应后,再在两侧的3'端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。本制品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成,所以它具有同pUC18载体完全相同的功能。此外,本制品中的高效连接液Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30分钟-1小时) 完成连接反应,大大地方便了实验操作。另外,本制品中还含有Control Insert (500 bp),可用于Control反应。
用途:克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物用M13 Primers进行DNA测序。

α互补和蓝白筛选的原理:许多载体(包括pMD18-T)都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸(α肽链)的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当二者产物组合在一起,就具有活性酶的产生,此现象称为α互补。由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来,它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链,而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的,而没有插入外源片断的则是蓝色的。
实验内容:
试剂
   pMD 18-T Vector试剂盒,或自己PCR扩增回收纯化的片段,T4DNA链接酶。IPTG,X-gal,LB培养基等。
   200mg/ml的IPTG 过滤除菌
   20mg/ml的X—gal 溶于二甲基甲酰胺,避光保存。
操作步骤
1. 在微型离心管中制备下述连接反应液,全量为10 l。

* 取0.5 l进行实验也可得到满意的结果。实际操作时,可按实验需要使用适量的T载体。
2. 16℃反应30分钟 (过夜反应也不影响连接效率)。
3. 全量 (10l) 转化至JM109感受态细胞 (100 l)中。
4. 在含有40l 20mg/ml的X-Gal、4l 200mg/ml 的IPTG、50-100g/ml Amp的L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
5. 挑选白色菌落,使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小。

注意事项:
1. Ligation Solution I 请于冰中融解。
2. 在进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为:1: 2 ~ 10。在本制品中, pMD18-T Vector 1 l (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol,Control Insert DNA 1l (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。
3. 克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化,PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。
4. 按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 l。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。
5. 连接反应请在16℃下进行,温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。
6. 连接效率偏低时,可适当延长连接时间至数小时。
7. 感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞,如:JM109,DH5a等。

相关问题
怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?
1. 纯化PCR产物。切胶回收的PCR片段最好
2. 除去残存的引物等杂质。
3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)小于短片段DNA,在使用大片段DNA的连接液进行转化时,建议采用电转化方法。

PCR产物难以插入载体,为什么?
1. 确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端, 如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005) 等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆;PCR产物保存时间不要过长, 长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。
2. PCR产物中短片段杂质DNA太多,这时应切胶回收纯化DNA片段,回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。
3. 确认感受态细胞的转化效率,使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/g pUC118 DNA。
4. 确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低,多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。
5. 确认抗生素的浓度是否过大。
6. 最好使用新配制的平板培养基。

转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色),为什么?
插入的PCR片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的读框时,平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。

插入的PCR产物进行测序时,可使用何种引物?
本制品的载体来源于pUC18载体。因此,用于pUC18载体测序的引物都可以使用。

实验:PCR扩增基因特异片段编辑本段回目录

实验目的:
    学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则;了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响;掌握PCR的基本操作。
实验原理
    PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物学研究中,广泛地应用于研究基因突变,获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面,是分子生物学中一项极为常用的技术。
    PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端,同两条模板的3'端互补,由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成,即在高温下模板双链DNA变性解链,然后在较低的温度下同过量的引物退火,再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板,因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上,经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1,考虑到扩增效率不可能达到100%,实际上要少些,通常经25~30次循环可扩增106倍,这个量足够分子生物学研究的一般要求。
    (一)PCR引物设计
    1.Tm值  Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数,是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50%的引物与模板配对,而另外50%的引物处于解离状态时的温度,Tm值一般高于55℃。合适的引物选择应需考虑到以下因素,如Taq酶的最适温度(TE)和Tm值等。最常用的Taq酶的最适温度(TE)范围为70~74℃,根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围(Ta)。这个温度范围应不高于酶的最适反应温度,也不能比TE-25℃更低。这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时,酶的合成反应会非常缓慢,但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。所以Ta的选择应满足TE-25℃<Ta<TE。
    2.引物的长度  引物长度一般在15~30个核苷酸之间比较合适。引物过短时造成Tm值过低,不能与模板很好地配对或是配对专一性很低。引物过长时又会造成Tm值过高,超过酶的最适反应温度,还使合成引物的费用大大增加。当然若要在引物的5'末端加上特定的酶切位点等碱基则可稍长。
    3.引物的GC%含量  引物的GC比最好设计在40%~60%的范围内。GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。如上所述,Tm值的估计可简单地根据经验式Tm=4×GC+2×AT+3.3℃获得。
    4.引物3′端起始碱基  Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的,延伸效率为T>G=C>A。即当引物3′末端为A时,即使有错配碱基也最不易延伸,所以引物设计时可将3′末端设计为A,以提高复制精确性。另一种理论是3′末端应设计为G或C,因为G和C的氢键多于A与T,能更好地与模板结合开始DNA合成,当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之,引物的3′末端不要考虑使用T。
    5.引物无发卡结构  引物自身应无发卡结构。
    6.二引物自身之间不能配对  二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基,特别是在引物的3′末端。二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同,若发生这种情况会形成引物二聚体,造成扩增失败。一般引物自身配对形成茎环结构,茎的碱基对数不大于3,两条引物间配对碱基数小于5个。
7.二引物的Tm值  引物设计时应注意使二引物的Tm值相近,否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度,将会影响PCR扩增效果。能同时达到最佳退火温度,将会影响PCR扩增效果。由于影响引物设计的因素比较多,所以常利用计算机来辅助设计,通常可用primer 5.0软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计。
    (二)PCR反应条件
    1.PCR缓冲液  常用的1×PCR缓冲液为10mmol/L Tris-HCl pH8.3(常温),50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2。由试剂公司与Taq酶一起提供。
    (1)Mg2+离子浓度:Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大,因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。Mg2+一般使用浓度为0.5~2.5mmol/L,必要时可以0.5mmol/L梯度间隔做Mg2+最适浓度试验。
    (2)dNTP:常用dNTP浓度为20μmol/L(可用范围为20~200μmol/L)。dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关,dNTP量过少时合成的产物减少。可以被Taq酶接受的经过修饰的dNTP有以下几类:dig-11dUTP、5—bromo-dUTP、biotin-11—dUTP、biotin-16—dUTP、7—deaza-dGTP和次黄嘌呤。但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的dNTP。
    (3)K+离子浓度:PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火,一般使用浓度是50mmol/L,但当K+离子浓度高于50mmol/L时会抑制Taq酶活力。
    (4)pH值:PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统。Tris-HCL缓冲系统的特点是具有很高的温度系数(0.021pH/℃),20℃时pH为8.3的缓冲液在72℃延伸反应时,实际pH值降低至7.2。而Tricine的温度系数较高,在扩增长片段时用Tricine系统。
    (5)保护剂:由于PCR反应体系中蛋白的含量极低,所以加人的酶非常容易变性,通常需加入一定量的保护剂。如5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT),100μg/ml的小牛血清白蛋白(BSA)或0.01%的明胶。加入保护剂对PCR循环数较多的扩增反应效果尤其明显。
2.模板  PCR模板可以是DNA或RNA,RNA需反转录后再扩增。模板可以是基因组DNA或纯化的质粒DNA,当然两者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。每个PCR反应中加入的模板数量可在102~105分子之间,必要时可低至50个分子,模板的量少时应酌情增加循环次数。小于100ng的哺乳动物细胞基因组DNA(相当于约104个细胞),经30个循环,10%的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时,循环数可减少;如果模板量很少,可能需要增加至45个循环反应。
3.引物浓度  常用引物浓度为0.1~0.5μmol/L。随着引物浓度的降低,PCR反应的特异性提高但产物得率降低;随着引物浓度的升高,情况正好相反。
    4.PCR反应中的酶  Taq酶最早是从水生嗜热菌(thermus aquaticus)中分离得到的,该酶的最适温度是72℃,在94℃时相当稳定,半衰期长达38min。由于这种酶使用最早最广泛,文献中所列各项最适反应条件都是针对此酶优化的,使用其它的聚合酶时按试剂盒使用说明书操作。
实验内容
仪器和试剂
1.仪器  PCR仪,微型水平电泳槽,电泳仪等。
2.试剂
(1)50×TAE电泳缓冲液 
(2)10×PCR缓冲液: 
(3)4种dNTP混和液 10mmol/L
(4)Pfu DNA聚合酶 (5U/μl)
(5)引物(20μM) 
(6)10×溴酚蓝上样缓冲液 
方法和步骤
1. 在PCR仪上设置好程序。
2. 在两个灭菌的0.5ml离心管中,按下列顺序加样,建立20μl反应体系。
ddH20 15μl
10×PCR Buffer 2μl
dNTP(10mM each) 0.5μl
Primer l(20μM) 0.5μl
Primer 2(20μM) 0.5μl
模板DNA (50ng)D16
Pfu DNA聚合酶(2.5U)               1μl
0.5μl
总体积                     20μl

对照水(空白对照)
    3.混匀,短暂离心.   
4.放在PCR仪上进行PCR反应。94℃变性3min,94℃45秒,64℃ 1分钟,72℃3分钟,20个循环。(用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖约50μl (一滴)液体石蜡油,改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖。)
5 . 取5μl PCR反应液及1μl上样缓冲液混合,进行琼脂糖电泳(5V/cm),选择适当大小的DNA分子量标准(DL2000),检查扩增产物。紫外观察,必要时拍照。
注意事项
1.PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的,因此,在进行PCR前,模板的纯化和引物设计尤为重要。
2.Mg2+对Taq DNA聚合酶的活性影响很大,有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时,不妨适当增加Mg2+的浓。

实验:逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段编辑本段回目录

实验目的   了解RT-PCR的原理,掌握 RT-PCR扩增基因的特异片段的技术。
实验原理
 PCR(Polymerase Chain Reaction;聚合酶链式反应)是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA,RNA不能直接被扩增,但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后,PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止,此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
编码蛋白质的基因在转录后形成mRNA,mRNA 翻译后编码产生蛋白质。真核生物的mRNA 的3端有多个腺苷酸,形成寡聚腺苷酸的尾巴,因此可以与Oligo dT结合,在反转录的作用下形成cDNA。再通过基因的特异引物PCR扩增得到基因的特异片段,此方法称为2步法。也可以根据已知基因的序列设计引物,以基因的特异引物进行逆转录,得到特异基因的cDNA,以此为摸板PCR扩增得到特异基因片段,由于此法转录和PCR扩增在同一反应管中进行,转录和扩增的引物相同,因此称为一步法。

聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

实验内容
材料 小鼠新鲜肝
试剂 总RNA提取纯化试剂:Trizol(Invitrogen);DEPC(Amersham)  无水乙醇,已丙醇;
     RT-PCR试剂盒 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)(大连宝生物生物公司)
本试剂盒采用了一步反应法(One Step法)完成RT-PCR反应。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中进行,反应中途不需添加任何试剂,就可以完成由AMV(Avian Myeloblastosis Virus)由来的反转录酶从RNA反转录为cDNA,再由AMV-Optimized Taq扩增cDNA的全部反应。本试剂盒中含有进行One Step法RT-PCR反应用的全部试剂,可以简便而有效地对RNA进行扩增分析。

 

聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

 本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒(质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段,其DNA片段上含有抗四环素基因)为模板由SP6 RNA聚合酶经体外转录而得到的。Control RNA(约1.4 kb)是带有30个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时,该质粒便可获得四环素抗性。

操作步骤
1总RNA的提取根据上次实验总RNA的提取进行。

2 按下列组成配制RT-PCR反应液。

聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

4反应结束后,取PCR反应液 (5 –10ul) 进行1%琼脂糖凝胶电泳,确认RT-PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验,应将PCR产物冷冻保存。
Control反应时扩增片段大小为462 bp。

 

 

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