该法是R.Treisman尚未发表的方法,同时也是Brinboim和Doly(1979)及Ish-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效,并可与随后的纯化步骤,如聚乙二醇沉淀或氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心等,一并联合使用。注:括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。 试验准备: 1、溶液I:50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液I可成批配制,在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min,贮存于4℃。 2、溶液Ⅱ: 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)1%SDS 盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。当溶液的pH值低于8.0时,溶菌酶不能有效工作。防止NaOH接触空气中的CO2所以要现用现配。 3、溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml。所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。 4、溶菌酶溶液: 10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。 试验步骤: 1、将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物,重悬于10ml(18ml)溶液I中。 2、加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液。 3、加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。 4、加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明的两个液相。于冰上放置10min,会出现一白色絮状沉淀。沉淀应包括染色体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。 5、用SorvallGS3转头(或与其相当的转头)于4℃以4000rpm离心15min,使转头自然停止转动。如果细菌碎片贴壁不紧,则可以5000rpm再度离心20min,然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分。 6、用4层干酪包布把上清过滤至一250ml离心瓶中,加0.6体积的异丙醇,充分混匀,于室温放置10min。 7、用Sorvall GS3转头(或与其相当的转头)于室温以500rpm离心15min,回收核酸。盐也会在4℃离心时沉淀下来。 8、小心倒掉上清,敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽,室温下用70%乙醇洗涤沉淀。倒出乙醇,并除去附于瓶壁的所有液滴,室温下将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发完全。 9、用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 |
→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条
上一篇如何研究一个基因的功能 下一篇DNA分型的法医学应用
词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0