本方法的核心部分是医科院基础所的生化脂蛋白组的吴刚老师所创，我在其基础上进行了一些改动，主要是DNA回收上采取了更简单的方法。（本方法最适用于双酶切制作片断并进行克隆的情况。对于分步酶切制作片断，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）

一、片断平移的克隆（也适用于多片断连接）

简介：将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μl ，要切出小片断的质粒B酶切7μl；琼脂糖回收胶电泳；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自B的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μl水、1μlligase Buffer、1μl ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。

酶切

配置可酶切共10μl质粒的酶切反应体系（双酶切）：

（提示 在克隆设计时尽量使用好切的内切酶<通常是效价高、便宜量大的酶>，且注意这两个酶有比较兼容的Buffer，即在这种公用Buffer中，两酶的效力变化不大<至少保持60%的活性>。酶切体系根据需要，可加入BSA。）

酶切体系

混匀

37℃，酶切3小时。

（提示 关于酶量的问题。通常的内切酶效价在10U/μl左右，3μl内切酶相当于30U，足够切10μl的质粒。因为通常小提质粒的浓度在200－600ng/μl，一般浓度达不到1μg/μl。根据1U酶切1μg质粒的原则，这一酶量是足够的。）

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5ml离心管中。（提示: 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）

3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μl Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μl枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μl的枪足够粗壮，不要用100μl的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）

6. 凝胶管中加入500μl双蒸水，盖紧，振摇200下。

7. 加入500μl Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5ml 离心管中加入 500μl 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5ml 离心管中加入 900μl 预冷 无水乙醇、20μl 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

10. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）

连接

向回收DNA的试管中加入8μl 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μl ligase Buffer，1μl T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μl，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）

二、PCR产物接入质粒的克隆

简介： 取100μl PCR产物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切体系酶切；将用作载体的质粒A（制作大片断）酶切3μl；切胶回收来自质粒A的大片段，和来自PCR产物的小片断，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μl水、1μlligase Buffer、1μl ligase ，4℃过夜；次日转化涂板。

PCR产物回收

1. 制备100μl PCR产物。

2. 将100μl PCR产物加入一1.5ml离心管中，再加入400μl双蒸水，颠倒混匀。加入 900μl 预冷 无水乙醇、20μl 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。

4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。

5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）

酶切

直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：

PCR产物酶切－制作插入片断

公用Buffer 6μl

酶 I 3μl

酶 II 3μl

PCR产物 ——

双蒸水 48μl

合计 60μl

要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒3μl进行酶切。

A质粒酶切－制作载体片断

公用Buffer 3μl

酶 I 1μl

酶 II 1μl

质粒 3μl

双蒸水 22μl

合计 30μl

混匀

37℃，酶切3小时。

1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）

1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。

2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5ml离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）

3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。

4. 取200μl Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。

5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μl枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μl的枪足够粗壮，不要用100μl的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶）

6. 凝胶管中加入500μl双蒸水，盖紧，振摇200下。

7. 加入500μl Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。

8. 在一新1.5ml 离心管中加入 500μl 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。

9. 在一新1.5ml 离心管中加入 900μl 预冷 无水乙醇、20μl 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）

10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风）

连接

向回收DNA的试管中加入8μl 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μl ligase Buffer，1μl T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μl，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）

三、一步法感受态细胞制作 （已经检验过DH5α和BL21系菌，采用此方法的转化效率足够高）

来自Nucleic Acid Research 1988 16 3580

Rapid and Convenient method for the preparation and storage of competent bacterial cells.

Chung CT, Miller RH.

下载链接：http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=336520