目的: 1.从人或动物血液中抽提DNA 。 2.从体液,唾液,尿液中抽提DNA 。 3.从人体组织,切片和各种临床样品中抽提DNA 。 4.抽提出的DNA 可以用于PCR及相关诊断。 原理: 临床常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA ,用于病症的辅助性分析和诊断。样品根据试剂盒(SK1341试剂盒,上海生工)提供的方法进行处理,然后在特定的DCL Buffer中用Protenase K和去污剂裂解。用UNIQ-10柱吸附样品中基因组DNA 。UNIQ-10能选择性吸附DNA ,而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。经简单的洗涤步骤,样品DNA 可用Elution Buffer回收。抽提出的DNA 可以用于PCR及相关诊断。 样品准备: 1.血液: ① 血液收集:血液必须用ACD(0.48% Citric Acid,1.32% Sodium Citrate,1.47% Glucose)抗凝。6ml血液用1ml ACD抗凝。因为从用肝素抗凝血液中抽提的DNA 常有PCR抑制剂存在,不能用于PCR反应。血液4℃可以存放2周左右,-20℃可以放置1~2月。 ② 由于红细胞和血小板不含细胞核,血液中的DNA 主要来源于白细胞和血液中的病毒等。通常从200µl血液中可获约2~4µg DNA 。如果需要较大量的DNA ,可以用500µl血液。处理方法如下:500µl血液中加入1ml无菌水,5,000转/分,离心2分钟去上清。用200µl TE将白细胞悬浮起来备用。 ③ 新鲜血样品如不能立即用于抽提DNA ,可置于4℃,但不要超过2个星期。欲长期储存,请分装成200µl/管,储存于-20℃。 2.血清 最好使用新鲜血清样品,否则样品应分装成200μl/管,-20℃保存。 3.生物组织: ① 5~30mg组织样品用手术刀切成小块,在液氮中碾碎。 ② 将粉末收集到1.5-ml离心管中,用200µl TE悬浮。 4.石蜡生物组织: ① 25~30mg石蜡生物组织样品用手术刀切成小块,转入2-ml离心管(用户自备)中。 ② 加入1.2ml二甲苯溶剂(用户自备)。用振荡器振荡。(目的是除去石蜡) ③ 用台式高速离心机,12,000转/分,室温离心5分钟。 ④ 小心移走上清,注意不要移走沉淀物质。 ⑤ 加入1.2ml无水乙醇,小心用振荡器振荡,室温放置1分钟。 ⑥ 室温,12,000转/分,离心5分钟。 ⑦ 重复步骤④~⑥一次以除去残留的二甲苯溶剂。 ⑧ 打开离心管盖,小心弃上清,37℃保温10~15分钟以除去残留的乙醇。 ⑨ 样品用200μl TE 悬浮。 5.生物体液: ① 将体液转移到离心管中,根据体液的性质,确定体液的用量。如果体液的体积小于200μl,可以直接使用。 ② 5,000 转/分,室温离心10分钟。 ③ 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。 |
6.尿液: ① 将尿液转移到离心管中,5,000 转/分,室温离心10分钟。 ② 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。 7.眼、鼻、喉等拭样(Swabs) ① 将拭样(Swabs)转移到离心管中,加入2ml PBS(或生理盐水,用户自备),室温浸泡2~5小时。 ② 5,000转/分,室温离心10分钟。 ③ 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。 8.福尔马林处理的样品: ① 将25~30mg福尔马林处理样品用手术刀切成小块,转入离心管(用户自备)中。 ② 加入2ml PBS(或生理盐水),室温浸泡30分钟。 ③ 5,000 转/分,室温离心10分钟。 ④ 小心移走上清,重复步骤②-③一次。 ⑤ 小心移走上清,沉淀用200μl TE悬浮。 注意: ① 如果样品的体积不足200μl,加入TE补足到200μl。 ② 如果样品不能马上用于抽提DNA ,可于-20℃保存备用。 ③ 样品不能反复冻融,否则DNA 的完整性(长度)和产率都会受到影响。 ④ 样品不要太多,否则DNA 的纯度和产率反而下降。 操作步骤: 1.在按样品准备方法制备的200μl样品中,加入400μl DCL Buffer,混匀; 加入3μl Proteinase K,混匀,55℃保温5~10分钟。 注意:① 应按次序加入,不得将Proteinase K先混入DCL Buffer,再加到样品中。② 保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品,55℃保温5分钟足以使细胞裂解,释放出DNA 。而对于组织类样品,55℃保温则视降解效果而定。降解完全的样品应是透明不粘稠的液体。组织类样品一般在1-3小时内作用完全。过夜处理通常不影响产率。 2.加入260μl 无水乙醇,混匀,然后用1-ml Tip头将样品全部转移到UNIQ-10柱,柱子放入2.0-ml Collection Tube。 3.用台式离心机,10,000转/分,室温离心1分钟。 4. 取下UNIQ-10柱,弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中,加入500μl Wash Solution,10,000转/分,室温离心1分钟。 5.重复步骤4一次。 6.取下UNIQ-10柱,弃去Collection Tube中的全部废液。将柱子放回同一根Collection Tube中,10,000转/分,室温离心1分钟,以除去残留的Wash Solution。 7.将柱子放入新的无菌的1.5 ml离心管中,在柱子中央加入50μl Elution Buffer,室温放置2分钟。 8.10,000转/分,室温离心1分钟。离心管中的液体即为DNA 。根据用途,样品可于4℃或-20℃保存。 注意:① 为提高洗脱效率,可以将柱子在37-55℃保温2分钟。② 如果样品中DNA 含量很低,用30μl Elution Buffer洗脱可以提高洗脱液的样品浓度。但是,产率有所下降。③ 重复步骤7-8,可以提高产率20%。 9.用分光光度计按1OD260=50µg测量DNA 含量,并通过0.7%琼脂糖电泳凝胶判定DNA 的完整性,也可以判定样品中是否有RNA 。该试剂盒抽提出来的DNA 长度可在50kb以上。 注意: ① 血液样品中的DNA 产量取决于血细胞的数量。 ② 从琼脂糖凝胶仅能观察到白细胞DNA ,血清中病毒DNA 因含量太少,不能用琼脂糖凝胶直接观察。③ 通常50μl PCR反应体系中用1-5μl DNA 抽提液。 主要参考文献:参阅Sangon提供的试剂盒操作手册。 |
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