一、标本的采集与处理

（一）标本的采集

1、病毒分离标本的采集

病毒分离成功与否很大程度上取决于采集标本的质量，及其保存、运输等环节。多数标本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。

标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液为：普通肉汤，pH7.4-7.6的Hank‘s、Eagle’s或水解乳蛋白液。为防止细菌和真菌生长，在采样液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、链霉素，近来发现不少种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌药物（终浓度为每毫升采样液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下几种：

1）鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。

2）咽拭子：用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，同样将棉签头浸入4-5 ml采样液中，尾部弃去。注：亦可将鼻、咽拭子收集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。

3）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器（国外有售）从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液涮洗收集器3次。由于该收集器国内难买到，也可采用国内一种设计装置（见郭元吉、程小雯著，流行性感冒病毒及其实验技术。中国三峡出版社P186，1997）。

4）鼻洗液：患者取坐姿，头微后仰，用移液管将1-1.5ml洗液注入一侧鼻孔，嘱患者同时发K音以关闭咽腔。然后让患者低头使洗液流出，用平皿或烧杯收集洗液。重复此过程数次。洗两侧鼻孔最多可用10-15 ml洗液。

5）漱口液：用10 ml洗液漱口。漱时让患者头部微后仰，发“噢声”，让洗液在咽部转动。然后，用平皿或烧杯收集洗液。

注：取鼻洗液和漱口液时，需预先了解患者是否对抗菌素有过敏史，如有则洗液和含漱液中不应含有抗菌素。

2、血清标本采集

血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期血样应尽早采集，最迟不超过发病后7天。恢复期血样应在发病后2-4周采集。单份血清一般不能用作诊断。血液标本2000-2500rpm离心15min。收集血清，弃血凝块。血清可在4℃存放一周，长期保存置-20℃。

（二）标本运送

标本应在低温下，24小时内运送至实验室。标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种的可置于4℃保存，如未能接种应置-70℃或以下保存。     血清标本可在4℃存放一周，长期保存置-20℃或以下。

（三）标本处理

标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后取出。鼻腔或咽部洗液，用手将装标本的管充分振荡，将粘液打碎。置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。

鼻咽漱液或抽取液：用无菌毛细吸管，在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同样置4℃待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接种或低温保存。

注：如采样液中尚未加抗菌素，应在接种前补加，用量同前，混匀后置4℃ 1-2h后方可接种。

二、病毒分离

病毒分离是流感诊断最常用和最可靠的方法之一。多用鸡胚来分离流感病毒。近来随着分子生物学技术的发展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与原始标本的有所不同，而通过MDCK细胞分离出的，其抗原性与原始标本的相似。另外由于“O”相毒株的重现，MDCK等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。因此，MDCK等一些细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此在病毒分离时同时采用鸡胚和MDCK细胞两套系统。     流感病毒“O”相毒株不凝集鸡红细胞，故近来在流感病毒鉴定中常用豚鼠或人红细胞来代替。然而，该两种细胞无细胞核，沉积慢，一般在红细胞凝集及凝集抑制测定中需60分钟才能观察结果，同时在“U”型孔板中，很难沉积成像眼泪样的点即当中常有小空洞。

（一） MDCK细胞分离

1、实验材料

MDCK细胞

Eagle氏培养液

Hank‘s溶液

0.25%胰酶和Versene消化液

双抗（青、链霉素）或庆大霉素和抗真菌素

胎牛或小牛血清

5.6%或7.5%的NaHCO3

细胞培养液配制

每500 ml Eagle’s 液加： 终浓度

双抗 5 ml 100U/ml青霉素

100ug/ml链霉素

胎牛或小牛血清 0.1-0.15ml/ml

使用前用NaHCO3 将pH调至7.4-7.6。

细胞维持液配制

同培养液，但不含胎牛或小牛血清，而含终浓度为2-3 ug/ ml 胰酶，用前用NaHCO3 将pH调至7.6-7.7。

注：目前市场上出售已配好的Eagle‘s试剂有两种：一种已含有谷氨酰胺，另一种不含。如不含，配工作液时需补加。

2、病毒接种和收获

1） 在低倍光学显微镜下检查MDCK细胞生长状态。

2） 成片的细胞弃生长液，用Hank’s液洗两遍，将残余的牛血清洗净，因牛血清中含有流感病毒非特异性抑制素，会影响流感病毒的复制。

3） 每瓶加入接种标本0.5-1.0 ml，轻摇细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附1-2h。

4） 倒掉感染液，再用Hank‘s液洗1-2遍，每瓶加入3 ml维持液，置35℃培养。

5） 次日起每天检查有无细胞病变（CPE）。CPE特征为：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或碎裂，严重时细胞部分或全部脱落。

6） 收获及红细胞凝集活性（HA）检查

当CPE出现+++ ~ ++++号时进行收获，收获之前也可将细胞冻融1-2次来提高收获标本的病毒滴度。由于无法证实CPE就是流感病毒所造成。最后还得看维持液中是否有红细胞凝集活性（HA）。用毛细吸管取维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混之，置室温或4℃，1h后观察结果。出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有维持液进行病毒鉴定，也可暂冰存之。有时将收获的维持液，离心弃沉渣，上清中加适量无菌甘油或明胶或1%牛血清白蛋白冻存之。

由于维持液中无牛血清，同时含一定量的胰酶和NaHCO3，故不应在4℃保存，否则易造成HA活性丢失和pH变高。如有清晰的CPE，但HA阴性应进行盲传。

注：维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力。绝大多数流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。细胞培养不像鸡胚，它的维持液中不含有蛋白水解酶，无法将病毒粒非裂解型的HA0 变成裂解型的HA1+HA2。故必须在维持液中加入适量的胰酶。CPE出现时间随感染病毒的型别，甚至毒株的差异以及感染量的大小而异。一般标本接种后7天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，可认为阴性标本，弃之。

7）传代及盲传

如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞或鸡胚中传代，把HA滴度提高或量增多。如HA可疑，细胞CPE清晰，此时应在MDCK细胞上盲传一代，如仍测不出HA，可认为是阴性。如仍有清晰的CPE并能排除细菌所引起也可认为是非流感病毒。

3、MDCK细胞传代

（1） 把需用的溶液置室温或37℃水浴中预热。

（2） 已成片的MDCK细胞，将其生长液倒掉。

（3） 把Versene与0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量应根据瓶大小不同而异）。

（4） 置37℃恒温箱5-10min，在此期间应在光学显微镜下观察1-2次，当细胞变圆，细胞与细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成片，表明消化时间未到。但千万不可消化时间过长，造成大量细胞从瓶壁上脱下，甚至造成破碎。

（5） 倒掉消化液，每瓶加入9 ml培养液，用毛细吸管将瓶壁上细胞轻轻吹下吹散。

吸出6 ml接种2小瓶，3 ml/瓶，将原瓶留下，置37℃恒温箱培养。

（7） 一般情况下，1瓶细胞传3瓶，如细胞急用，可一传二。不急用，可一传四等。有时为了控制细胞的代数，可一传八，这样一星期传一代就可以了。一般情况每2-3天需传一代。

4、MDCK细胞保存及复苏

MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应使用液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。

（1）MDCK细胞保存

将单层细胞消化分散成为单细胞；加入0.9 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亚砜；相混收集于保存小管中；缓慢冻存：放4℃2h，转放-20℃2h，再转放液氮中长期保存，也可置-70℃短期保存。

（2）MDCK细胞复苏

细胞冻存管从液氮罐取出后，速放37℃水浴溶化，溶化后加入3 ml培养液，混均后加入细胞培养瓶中，置37℃CO2孵箱培养。

（3）MDCK细胞对流感病毒敏感性测试

前面提到MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏感性。其具体测试方法：选一株对MDCK细胞较敏感的流感病毒株，最好为当前在人群中流行的甲型流感病毒。在同一条件下，用早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCID50测定。如果测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，表明其对病毒的敏感性已下降，不应继续使用；如果两者相差不超出一个Lg，表明可继续使用。

（二）鸡胚分离及HA测定

1、实验材料

♦ 9-11日胚龄鸡胚及验蛋器。禽流感分离时，必需用SPF鸡胚。

♦ 2.5%碘酒和75%酒精及液体石蜡。

♦ 钻孔器，蜡和胶布及照卵灯。

♦ 1 ml注射器和针头。

♦ 镊子，毛细吸管，橡皮乳头，试管架，试管。

♦ 采集的标本。

2、实验步骤

（1）接种（羊膜腔和尿囊腔接种即双腔法）。

1） 接种前先用验蛋器检查鸡胚，弃去死胚，未受精卵及不健康的鸡胚。画出气室边缘和胚胎位置。

2） 在气室端靠近胚胎侧之卵壳上钻一长方形裂痕（约10×6mm）或两条相隔3 mm的10 mm长的平行裂痕，勿损伤壳膜。

3） 钻口处用75%酒精消毒，用消毒过镊子除去长方形卵壳和壳膜外层（壁层）或将平行裂痕撕成长方形。

4） 从孔中滴入一滴无菌的液体石蜡，然后，轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清晰地看到鸡胚的位置。

5） 注射器吸取处理过的标本0.4 ml，将注射针头刺入胚胎的颚下胸前，用针头轻轻拨动下颚和腿，当针头进入羊膜腔时，能见到鸡胚随着针头的拨动而动，此时可注入0.1-0.2ml接种物，而后，将针头退出至尿囊腔再注射0.1-0.2ml接种物。

6） 注射器取出，用沾有碘酒通过火焰的小块胶布封口。

7） 置35℃恒温箱孵育72h。

（2）收获

1）收获前先将鸡胚移至4℃过夜，或置-20℃冷冻1h。快速冷冻时间不易过长，一旦鸡胚冻成冰块就无法收获。4℃冷藏也不宜过长，过长易造成散黄，影响收获。

2）75%酒精消毒鸡胚气室部分。

3）用无菌镊子将消毒过的壳打碎，再用另一把无菌镊子将壳膜和绒毛尿囊膜撕开，并将鸡胚轻轻推向一侧，压住。

4）用毛细吸管先收尿囊液，然后左手持小镊子夹起羊膜成伞状，右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收获0.5-1.0

ml羊水。如羊水过少，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取洗液。

（3）HA活性测定

尿囊液和羊水分别取3-4滴于血凝板孔中，加等容量1 %豚鼠或人红细胞，摇匀，置室温或4℃ 1h，而后观察结果。HA阳性标本须进行鉴定。标本可置4℃保存3-4天，长期保存应置-70℃或以下低温冻存。

（4）传代与盲传

HA滴度过低或收获的量过少（如羊水），应按上法进行传代来获得足够量的病毒。HA测定可疑的标本应按同法盲传一代，如再阴性，可认为阴性，弃之。一般流感监测中，每份标本可只接种2-3个鸡胚，当羊水和尿囊液中查不到HA活性，可认为阴性标本，不必进行盲传。

三、病毒鉴定

至今对流感病毒鉴定最常用的方法为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便、易行、结果可信。HI试验分常量法和微量法两种。微量HI法是目前国际普遍使用的方法，也是WHO流感监测中推荐使用的标准方法。HI试验的原理是流感病毒表面具有的血凝素蛋白能和含有唾液酸的受体物质特异结合，红血球浆膜上含有这类物质，当一定量病毒和适当比例的红血球混合后发生凝集，此为血凝现象。而用流感病毒特异性抗体和病毒作用，干扰了病毒和红血球的结合从而抑制了血凝，此为血凝抑制现象。这就是传统流感病毒的鉴定的理论依据。微量HI法实验步骤如下：

（一）实验材料

1、分离培养物（标本）

2、标准血清 常规鉴定用， 包括甲1、甲3和乙型流感代表株的至少3种抗体；

3、红血球 0.5%鸡红细胞或.75%豚鼠红细胞

4、受体破坏酶（RDE）

5、PBS或生理盐水

6、96孔微量板

7、可调多通道移液器和单通道移液器及滴头

8、其他水浴箱等

（二）HI试验操作过程

1、加PBS或生理盐水25ul于96孔板的第B行至H行的每一孔。

2、加1：10稀释的经受体破坏酶处理过的标准血清50ul于A行的每一孔。

3、用多通道移液器从A行各孔取25ul血清，倍比稀释至H排各孔，弃去25ul。

4、25ul被检病毒的4个血凝单位抗原加至各孔，混匀，室温静置15-30min，

5、然后加50ul的红血球（0.5%鸡红细胞或0.75%豚鼠红细胞），

6、室温静置30-60min（鸡血球30min；豚鼠血球60min）后观察结果。

结果判定

血凝被完全抑制的血清最大稀释度的倒数为血凝抑制试验的终点，该孔稀释度即为HI试验的效价。

附一：受体破坏酶处理血清

目的是去除非特异性血凝抑制素。因为人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素，它们是游离在血清中类似病毒受体的唾液酸残基，能与病毒血凝素分子上的受体结合，会竞争抑制病毒与红血球的结合，因而造成假阳性，因此HI试验必须用受体破坏酶处理血清。具体操作如下：

1、3体积的RDE，1体积的血清（0.3ml RDE ： 0.1ml血清）混合。

2、37℃水浴过夜。

3、56℃ 30min失活。

4、加入6体积的PBS或生理盐水混合，使血清稀释为1：10备用。或者按4：1处理后，倍比稀释为1：10备用。

附二：去除非特异性凝集素

处理过的血清可能与红细胞发生非特异性凝集。如血清中存在非特异性凝集，按下述方法处理：

1、用1体积的红细胞和20体积的RDE处理过的血清充分混匀。

2、搁置4℃ 1小时，其间使沉降红细胞再悬浮、混匀。

3、900 X g 5min离心。

4、取上清，反复上述操作直至血清与红细胞的吸附阴性为止。

附三：4个血凝单位抗原的调制

病毒培养阳性的标本首先确定其HA滴度，在此基础上调制4个血凝单位抗原，用于HI 试验。HA测定和4个血凝单位抗原的调制方法如下：

1、HA测定

1）50ul的PBS或盐水加入96孔微量板A-H行的2-12孔。

2）被检病毒各50ul分别加入A-H行的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50ul，12孔为阴性对照。

3）加50ul的红细胞于每一孔，注意从低浓度至高浓度加入。

4）混匀、室温静止30min（鸡血）或60min（豚鼠血）。

5）确定HA滴度。

判定：完全血凝的最高稀释度的倒数为血凝滴度。完全凝集为+，不完全凝集+/-，无凝集为-。

2、4个血凝单位的调制和再确认（复核）

（1）调制4个血凝单位

1个血凝单位指能引起等量红细胞凝集的病毒量。HI滴度是基于此测定的。试验中需调制 4个血凝单位，首先根据HA滴度，用8除其商为8个血凝单位的稀释度。如某待检病毒的HA滴度为160，除8等于20。即1：20（某标准参比抗原病毒0.1ml 加 1.9ml PBS）稀释病毒即得到8个血凝单位。注意HI试验所需4个血凝单位指25ul病毒含4个血凝单位，而第二步确定所稀释病毒是否为4个血凝单位的HA试验用50ul体系，所以先调制为8个血凝单位。确认4个血凝单位试验的具体操作如下：

1）50ul的PBS或盐水加入96孔板的第2-12孔。

2）调制的8个血凝单位抗原100ul加入第一孔，然后倍比稀释至第6孔弃去50ul。

3）各孔加红血球50ul混匀，视血球的不同静置 30-60min观察结果。

（2）结果判定

若第1、2、3、4孔完全凝集，第5孔不凝集，表明该稀释病毒准确，可用于HAI试验。如果第5孔也完全凝集说明该50ul病毒含16个血凝单位，需等量稀释病毒，如果只有前3孔凝集，说明该50ul病毒含4个血凝单位，病毒量需加倍。另外，注意4个血凝单位须每次用前新鲜配制。

附四：HI试验鉴定未知病毒时注意事项

1、正确选用96孔微量板，根据所用红血球不同来决定，鸡血球选用V型板，豚鼠、人血球用U型板。

2、红血球的浓度和4个血凝单位的正确调制。

3、标准参比血清应包括疫苗株和代表株的。

4、孵育时间不宜过长，因为有些病毒的血凝现象因病毒游离而很快消失。

5、由于流感病毒不同亚型间有交叉反应，判定结果时要注意。

如试验用4种标准血清，待检病毒只能被甲3抗血清抑制，抗体效价为80，其他血清皆不抑制，那么，该鉴定病毒为甲3型流感病毒，HI效价为80。如果7待检病毒被甲3抗血清抑制，效价40，甲1抗血清抑制，效价320，其高出甲3抗血清效价4倍以上，故该待检病毒判定为甲1型流感病毒。

标准参照血清对分离物的抑制效价≥20才可判断为阳性。

若标准参照血清对分离物的抑制效价均<20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。

6、鉴定未知病毒时对照应有红细胞、阴性血清对照、标准血清对照。

HI试验不适用于流感的早期诊断，但在不能分离病毒或病毒分离阴性时，检测病人的急性期和恢复期双份血清有助于近期感染的诊断，即如恢复期血清抗体效价（滴度）高于急性期血清抗体效价≥4倍确诊可成立。

附：世界卫生组织（WHO）甲5型（H5）流感病毒鉴定试剂盒的使用

1、血凝抑制试验（HAI）试剂

（1）灭活甲5型（H5）病毒抗原 10ml

（2）冻干抗甲5型（H5）病毒A/Tern/S.Africa/61（H5N3）羊血清

（3）冻干抗甲5型（H5）病毒A/Goose/Hong Kong/437-4/99（H5N1）鸡血清

任何无法用WHO2002-03普通流感试剂盒鉴定的毒株须用本试剂盒提供的抗甲5型（H5）病毒血清进行鉴定，如果发现甲5型病毒（只能被抗甲5型（H5）病毒血清抑制而不被抗甲1或抗甲3病毒血清抑制的甲型流感病毒），须立即上报国家流感中心，WHO总部或任一WHO流感协作中心。

2、霍乱滤液（RDE）处理标准抗血清去除非特异性抑制素

（可用WHO普通流感试剂盒提供的RDE）

（1）用1ml蒸馏水溶解冻干甲5型（H5）病毒抗血清，溶解后的血清可于-20℃或-70℃保存。

（2）用25ml无菌生理盐水溶解RDE，分装包存。

（3）1份血清加3份RDE（0.1ml血清加0.3mlRDE），混合后37℃水浴过液。

（4）56℃水浴加热30分种以灭活RDE。

（5）待冷却至室温后加6份（0.6ml）生理盐水混合。

经RDE处理后血清已1：10稀释，1ml处理过的血清可检测20份病毒。

3、红细胞吸附去除血清非特异性凝集素

（1）20份经RDE处理的血清加1份洗涤后沉淀的红细胞，混匀。

（2）置4℃冰箱1小时，其间不时摇动混合。

（3）离心沉淀红细胞（900g，5分钟）

（4）小心吸取上层血清待用。

4、血凝试验（HA）检测标准抗原及待检病毒滴度

（1）根据所用红细胞选择适当96孔微量板（如用豚鼠或人O型红细胞时，应选用孔底呈U型的微量板，如用火鸡或鸡红细胞时，应用孔底呈V型的微量板）。

微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1-H1称第1列；水平方向称行，如A1-A12称A行。

（2）除第1列外（A1-H1），每孔加50ul PBS（0.01M， pH 7.2）

（3）A1-G1每孔各加100ul标准抗原或待检病毒，H1加50ul PBS作阴性对照。

（4）用多孔加样器从第1列各孔分别取50ul抗原，由第1至第12列做对倍稀释，最后1列弃去50ul。

（5）每孔加50ul红细胞，轻弹微量板，使细胞与病毒充分混合。

（6）室温孵育30-60分钟，观察血凝现象并记录结果。

红细胞凝集以“+”记录，只有部分凝集为“+/-”，无凝集为“0”，出现全部红细胞凝集的最高稀释度为终点，该稀释度的倒数即是病毒的血凝滴度。

5、制备4个血凝单位的抗原

（1）首先计算血凝抑制试验所需每个抗原的用量，如1份血清作8孔稀释，每孔用25ul，那么测定1份血清需0.2ml抗原。

（2）其次计算出病毒稀释度，用病毒的血凝滴度除8，商即为获得4个血凝单位的稀释度。如某病毒的血凝滴度为160，除8等于20。那么1：20稀释该病毒即可得到4个血凝单位。

（3）为了保证血凝抑制试验中抗原量一致并准确无误，新配制的4个血凝单位的抗原须复核滴定：取50ul4个血凝单位的抗原，用等量PBS做对倍稀释。每孔加50ul红细胞，混合后室温孵育30-60分钟观察血凝。如只有前4孔出现血凝，说明该病毒稀释准确（即每50ul含8个血凝单位的抗原。因为血凝抑制试验中只用25 ul抗原，故称4个血凝单位）。如第5孔也出现血凝，说明每50ul含16个血凝单位，须等量稀释。如仅前3孔出现血凝，说明每50ul含4个血凝单位，病毒量须加倍。

6、血凝抑制试验（HAI）鉴定待检病毒

（1）根据所用红细胞选择适当96孔微量板，每个微量板可检测两种抗原。

（2）除A行（A1-A12）外，每孔加25 Upbs。A6，A7各加50 uPBS。

（3）标准抗血清（经RDE处理）

抗甲1型（H1N1）血清 WHO普通流感试剂盒提供

抗甲3型（H3N2）血清 WHO普通流感试剂盒提供

抗甲5型A/Tern/S. America/61（H5N3）羊血清

WHO甲5型（H5）流感鉴定试剂盒提供

抗甲5型A/Goose/Hong Kong/437.4/99（H5N1）鸡血清

WHO甲5型（H5）流感鉴定试剂盒提供

阴性对照血清 WHO流感鉴定试剂盒提供

A1-A5及A8-A12分别各加一种上述标准抗血清，每孔50ul。

（4）用多孔加样器从A行各孔分别取25ul血清，由A行至H行做对倍稀释。最后1行弃去25ul。

（5）A1-H5每孔加25ul标准或待检抗原1，（4个血凝单位抗原）

A8-H12每孔加25ul抗原2，（4个血凝单位抗原）

轻弹微量板，使血清与病毒充分混合，室温孵育15分钟。第6，7两列（A6-H6及A7-H7）不加病毒作阴性对照。

（6）每孔加50ul红细胞，混匀，室温孵育30-60分钟观察血凝抑制结果。

当特异性抗体与相应的血凝素抗原结合后，可抑制病毒引起的血凝现象。血凝抑制效价是抑制血凝出现的血清最高稀释度的倒数。如1：80稀释的血清不出现血凝（完全抑制），而1：160稀释时出现血凝（无血凝抑制），该血清对测定病毒的血凝抑制效价是80。