一、重组DNA技术相关概念 (一)DNA克隆 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化(cloning):获取同一拷贝的过程,即无性繁殖。 1.分子克隆(DNA克隆) 2.细胞克隆 3.个体克隆(动物或植物) DNA克隆: 应用酶学的方法,在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。又称基因克隆或重组DNA。 基因工程: 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作,又称为重组DNA技术 (recom-binant DNA technology)。 (二)工具酶 1.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端:钝性末端(blunt end)粘性末端(sticky end) 限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端(compatible end),可用连接酶连接。 2.DNA聚合酶I 3.逆转录酶 4.DNA连接酶 5.碱性磷酸酶 6.末端转移酶 7.Taq DNA聚合酶 (三)目的基因 应用重组DNA技术所要分离、获得的基因。 1.cDNA(complementary DNA):是指经反转录合成的,与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板,经聚合反应可合成双链cDNA。 2.基因组DNA(genomic DNA):是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 (四)基因载体(vector) 能携带目的基因,实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。 常用的载体:质粒、噬菌体DNA、病毒DNA载体的选择标准: 能自主复制; 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点; 分子量小,以容纳较大的外源DNA。 1.质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。大小约为数 千碱基对。常有 1 ~ 3个抗药性 基因,以利于筛 选。 2.噬菌体(phage)DNA λ 噬菌体DNA改造系统 λ gt 系列(插入型,适用cDNA克隆) EMBL系列(置换型,适用基因组克隆) M13噬菌体DNA改造系统(含lac Z基因) M13mp系列 pUC系列 3.其他 柯斯质粒(cosmid) 酵母人工染色体载体(yeast artificial chromosome,YAC) 细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC) 动物病毒DNA改造的载体(如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒) |
二、重组DNA技术基本原理 (一)目的基因的获取 1.化学合成法:用于已知序列,或可推导出序列的基因 2.基因组DNA 基因组DNA文库(genomic DNA library):存在于转化细菌内,由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。简称G-文库。 3.cDNA: cDNA文库(cDNA library)用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后,建立的基因文库。简称 c-文库。 4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) PCR是根据DNA复制的原理,在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术。 PCR的反应体系:模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2++的缓冲液。 PCR的基本反应步骤: 1.变性:将反应系统加热至95℃ ,使模板DNA完全变性成为单链; 2.退火:将温度下降至50℃左右,使引物与模板DNA退火结合; 3.延伸:将温度升至72℃ ,DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。 上述三个步骤为一个循环,经25~30次循环后,可将模板DNA扩增达百万倍。 (二)克隆载体的选择 (三)外源基因与载体的连接 1.粘性末端连接 2.平端连接 限制性内切酶作用产生的平端粘端经特殊酶处理变为平端 3.同聚物加尾连接 由末端转移酶作用,在DNA片段末端加上同聚物序列,制造出粘性末端再连接。 4.人工接头 由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸,再用限制酶切产生粘性末端,进行连接。 (四)重组DNA导入受体菌 受体菌条件:安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 导入方式:转化 转染(transfaction) 感染(infection) (五)重组体的筛选 重组DNA导入受体菌后,经过培养使其大量繁殖,再设法将含有目的基因的菌落区分鉴定出来,这一过程即为筛选(screening)或选择(selection)。 1.直接选择法:针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因而设计的筛选方法。其特点是直接测定基因或基因表型。 抗药性标记选择(插入失活法):将目的基因插入带ampr和tetr基因载体的tetr基因中,则tetr基因失活。在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养,进行筛选。 标志补救(marker rescue) 若目的基因能够在宿主菌表达,且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补,就可利用对营养素的依赖表型来筛选。 分子杂交法:利用32P标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的转化子DNA或克隆的DNA片段进行分子杂交,直接选择并鉴定目的基因。 原位杂交 Southern印迹 2.非直接选择法: 免疫学方法:利用特异抗体与目的基因表达产物相互作用进行筛选。包括: 免疫化学方法 酶免检测法 |
(六)克隆基因的表达 表达体系的建立: 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离、纯化 1. 原核表达体系 E.coli的标准: 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli的不足: 缺乏转录后加工机制 缺乏翻译后加工机制 表达产物形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白 2. 真核表达体系 如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞 优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区积累 缺点:操作技术难、费时、不经济 转染:将表达载体导入真核细胞的过程 三、重组DNA技术与医学的关系 疾病基因的发现 发展生物制药 DNA诊断 基因治疗 遗传疾病的预防 |
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