一、实验目的 ：

1、 掌握质粒DNA 分离，纯化的原理

2、 学习煮沸法快速提取质粒DNA 的方法

3、 学习DNA的限制性酶切的基本技术

4 、 学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度

二、实验原理

在基因工程中，DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA 序列，在一定的条件下切断双链DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基化程度等。对DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。

琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的DNA 。长度 100kb 或更大的DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。

在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。

三 、实验材料和试剂：

1． 菌种：含 pUC18 的大肠杆菌 JM107 菌株。

2． 化学试剂和溶液

（1） LB 培养基：

NaCl 10g/l 酵母提取物 5g/l

胰蛋白胨 10g/l 氨苄青霉素 50 μ g/ml （培养基灭菌后加入） pH7.0

（2） 70% 乙醇 （-20 ℃）及无水乙醇（ -20 ℃）

（3） STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）

（4） 5%CTAB （十六烷基三甲基溴化氨）

（5） 1.2M 氯化钠

（6） TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）

（7） 电泳缓冲液（ 50XTAE ）

Tris 242g， 冰醋酸 57.1ml，EDTA(0.5mol/LpH8.0) 100ml 使用时用蒸馏水稀释 50 倍。

（8） 样品缓冲液（ 6X ） 0.25% 溴酚蓝， 0.25% 二甲苯青， 40% （ W/V ）蔗糖

（9） 溴化乙锭 10mg/ml

（10） 琼脂糖（电泳级）

（11） 限制性内切酶

（12） 溶菌酶（ 50mg/ml ，溶于 10mmol/L Tris-HCl ， pH 8.0 ）

3.仪器设备:

台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、恒温水浴箱等。

Eppendorf 离心管， Tip 头，三角瓶等灭菌备用。

电泳仪，电泳槽，样品梳，微波炉，水浴锅，移液器（ 20μl, 200μl 和 1000μl ），离心管，Tips(200μl,1000μl) 。

四 、操作步骤：

1.质粒提取

（1） 将2ml 含相应抗生素的 LB 培养基加入到容量为15ml 的试管中，接种一单菌落，用棉塞封口，在37 ℃剧烈震荡（ 250rpm ）培养过夜。

（2） 将1.5ml 培养物转入离心管中，用台式离心机在4 ℃条件下离心 30 秒（12,000 × g ）。

（3） 弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体培养基，将细菌沉淀物悬浮于 200 mlSTET 缓冲液，用涡旋混合器充分混匀。

（4） 加入4 ml新鲜配制的溶菌酶液，混匀，置室温下5min 。

（5） 用漂子架住离心管，置于沸水浴中，精确记时45 秒，取出后立刻离心10min 。

（6） 用无菌牙签挑取离心管中的沉淀物弃去，离心管的上清液中加入8 ml5%CTAB ，用混合器混匀后，高速离心5min ，弃上清液，用滤纸吸干离心管中的液体。

（7） 加入1.2M 氯化钠 300 ml，充分溶解沉淀物，再加入750 ml的冷乙醇，充分混匀后，离心15min ，弃上清液。

（8） 取1ml 70% 冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心 5min 。弃上清液，用滤纸吸干管壁上的液体，置室温中使核酸沉淀自然干燥 5-10min 。

（ 9 ） 沉淀物溶于 50 mlTE 缓冲液中，混合器混匀 。

（10） 即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用

加完反应液，混匀，离心 1分钟，置于37℃水浴中，反应2小时。加入加样缓冲液（10 ′） 2 ml

3. 质粒DNA的琼脂糖电泳

1) 量取100毫升TAE电泳液，加入0.7克琼脂糖，混匀后，置于微波炉中，加热

3分钟，充分溶解琼脂糖。 注意观察，当心煮沸的液体，溢出！

2) 用灭菌后的橡皮胶，封闭清洁干燥的电泳板，并用少量的琼脂糖液封边。安放梳子，调整梳子的底部边缘与电泳板之间的距离，一般以 1-2毫米为宜。

3) 当溶解后的琼脂糖液冷却至 50℃左右时，加入溴化乙锭5 ml，溴化乙锭的最终浓度为1.0 m g/ml . 混匀后，将琼脂糖液倒入电泳板中，静止，切勿移动。

4) 在凝胶完全凝固后（于室温放置 30-45分钟），轻轻地取出梳子，除去胶带，将凝胶放入电泳漕中。

5) 电泳漕中，加入电泳液（1 ′ TAE），使电泳液覆盖在琼脂糖胶面之上约1-2毫米。

6) 取上一实验制备的质粒提取液（酶切），加入1/5样品缓冲液，充分混匀。用移液器将样品小心地加入点样孔。在不同的点样孔中，分别加入DNA分子量标记物（marker ），对照以及质粒提取液（酶切）样品

7) 接通电源，在 90V下，电泳1小时，当溴酚兰颜料迁移至凝胶前沿时，切断电源。

8) 取出凝胶，在紫外灯下，观察 DNA的迁移位置，并讨论实验结果。

五、注意事项 :

(1) 从细菌沉淀中或核酸沉淀中去除上清液时，一定要彻底，不能留有残余。

(2) 用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分小心，防止将核酸同洗液一起去掉。

(3) 在实验过程中所用的器皿和吸头等都要进行高压灭菌。

(4) 酶切时，应尽量减少反应中的加水量以使反应体系减到最小。但要确保酶体积不超过反应总体积的十分之一，否则限制酶活性将受到甘油的抑制。

(5)进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后再从冰箱中取出酶，并应放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头 。 操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱