聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA 片段,从而免除基因重组和分子等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化,因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。 PCR进行的基本条件是: (1)以 DNA 为模板(在RT-PCR中模板是RNA ); (2)以寡核苷酸为引物; (3)需要4种dNTP作为底物; (4)有 Taq DNA 聚合酶。 PCR每一个循环由三个步骤组成: (1)变性加热模板DNA ,使其解离成单链; (2)退火降低温度,使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序列结合; (3)延伸在适宜温度下,Taq DNA 聚合酶利用dNTP使引物端向前延伸,合成与模板碱基序列完全互补的DNA 链。 每一个循环产物可作为下一个循环的模板,因此通过35个循环后,目标DNA 片段可能性扩增可达235 倍。 PCR的影响因素: (1)模板 单、双链DNA 或RNA 都可作为PCR的模板,若起始材料是RNA ,需先通过逆转录反应得到一条cDNA 。为提高PCR反应的特异性,所加DNA 模板量应作相应的调整,如DN A(ng),染色体DNA (μg),待扩增片段(104 拷贝数量)来作起始材料。原料可以是粗制品,但不能混有蛋白酶、核酸酶、TaqDNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。 (2)引物 引物是决定PCR结果的关键。引物的设计应遵循以下原则: ①引物的长度一般为18-25个碱基 ②G+C含量一般为40-60% ③碱基的随机分布 (3)反应温度和时间 PCR涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃,45秒至1分钟,过高温度或持续时间过长会降低TaqDNA 聚合酶活性和破坏dNTP分子。退火温度可选择比变性温度(Tm )低2-3℃,变性温度按Tm =4(G+C)%+2(A+T)%计算。在Tm 值允许的范围内,较高的退火温度有利于提高PCR特异性,退火时间一般为0.5-1分钟。延伸温度为72℃,时间与待扩增片段长度有关,一般1Kb 以内片段延伸时间为1分钟,如扩增片段较长可适当增加时间。 (4)Taq DNA 聚合酶 目前有两种Taq DNA 聚合酶供应:从噬热水生菌中提取的天然酶和大肠杆菌表达的重组TaqDNA 聚合酶(Ampli TaqTM )。两种酶都有5’-3’外切酶活性,但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR中,它们可以相互替代,催化典型的PCR所需酶量为l~2.5单位。酶量偏少则PCR产物相应减少,酶量过高则会增加非特异性反应。 (5)dNTP浓度 dNTP在饱和浓度(200 μmol/L)下使用。由于 dNTP溶液有较强酸性,配制时可用 l mol/L NaOH溶液将其贮存液(50 mmol/L)的 pH调至 7.0~7.5。分装小管于-20℃保存。过多冻融会使其降解。(6)PCR缓冲溶液 在反应体系中二价阳离子的存在至关重要,镁离子优于锰离子,而钙离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错配率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响,镁离子浓度一般在 0.5~2.5 mmol/L之间。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时,尤其要调整Mg+2 浓度至最佳。 本实验从小鼠肝脏中提取的DNA 中扩增β-actin基因,其片段长度为800 bp。 PCR扩增仪、掌式离心机、0.5ml PCR 管 1.PCR扩增试剂盒 2.引物1:5 ATCTGGCACCACACCTTCTACAATG 3? 引物2:5 CGTCACACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC 3? 3.标准DNA :DL 2000 1.在0.5ml PCR塑料管中加入下列物质,并混匀。 10×PCR buffer(free Mg +2 ) 5μl 25mmol /L MgCl2 dNTP 3μl 4μl 引物1 0.5μl 引物2 0.5μl Taq(5U/μl) 0.25μl 模板(DNA < 0.1μg ) 5μl ddH2O 总体积 31.75μl 50μl 2.将上述PCR反应混合物混匀放入PCR仪中。 3.PCR循环: 94℃ 5 min 1个循环 94℃ 45 Sec |
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