质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段( <10kb) 且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段,然后体外使两者相连接,再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中,如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA 片段和载体DNA 的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α 互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种: 1、带有非互补突出端的片段 2、带有相同的粘性末端 3、带有平末端 |
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