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DNA测序常见问题分析及解决办法总结

标签: DNA测序

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常见问题

具体情况

可能的原因

处理办法

备注

样品准备问题

菌培养不好或失败

抗性不对或菌已死

核对抗性,尽可能提供载体信息。

 

或菌培养条件特殊

重新提供菌液,或提供2μg纯化质粒。

质粒提不出

质粒拷贝数极低或

客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。

 

培养方式不当

质粒产量很低

低拷贝数质粒或

客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。

 

培养方式不当

自带质粒或已纯化PCR产物量极低

是否为电泳法定量,

质粒:电泳检测浓度大于100ng/ul,体积大于20ul。

测OD值法不可靠,电泳检测

总量是否足够

已纯化PCR产物:根据片段长度提供足够量的模板,一般要求是100ng/反应/Kb,进行多个反应的应相应增加量。

测序出现双峰或信号中断

双峰

重复序列,如polyT、polyA或几个碱基重复

用反向引物测互补链。

此类问题主要与样品有关

质粒测序在插入序列中出现套峰

可能是样品非单克隆,挑其他测序。

PCR产物测序中,某一点后序列变乱

可能是存在移码突变,这是正常的,也可以后测序。

PCR产物中一个或多个位置有套峰

序列中存在突变,这是正常的,也可以后进行测序。

PCR产物测序前部分双峰

引物二聚体污染或产物不纯,后测序。

质粒测序时整个结果双峰

引物特异性不好,序列中存在通用引物的同源序列;改用其他引物测序。

质粒和PCR产物测序出现双峰

引物不纯,测序时只要单一引物,请不要将双向PCR引物混合;合成的引物没有纯化,或纯化不好。重新合成引物测序。

信号迅速衰减或中断

模板GC二级结构区后

难以得到好的测序结果,亚成较小的片段进行测序

 

模板GT二级结构区后

测反向互补序列,AC结构不影响测序

 

严重的重复结构

测反向互补序列

 

模板特性决定的

根据具体情况决定

 

信号极弱或无信号

模板质量差

重新提供菌液或纯化PCR产物

 

质粒样品:引物不符

尽量提供载体详细信息,核查引物

 

引物不适宜测序

测序引物比PCR引物要求高,随机引物和简并引物不能用于测序,较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序,对PCR产物而言建议到载体上用通用引物进行测序

 

质粒产量极低

客户自己提供2μg纯化好的质粒

 

PCR产物定量极低

重新电泳检测已纯化的PCR产物,确认有足够的量,或提供PCR原液由公司进行纯化

 

测序结果正常,与预期不符

找不到引物

质粒模板

检测是否为空载体,从其互补链上寻找,位点离测序引物太近,长插入片段未测通。

 

PCR模板

不可能找到所用的测序引物,短片段可以从互补链上找到另一段的引物,长片段由于测不通,无法找到相应序列想得到全序列,短片段可以从两端进行测序,长片段需要经后进行测序。

结果完全不对

请提供详细资料我们会根据结果具体分析。

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