常见问题
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具体情况
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可能的原因
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处理办法
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备注
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样品准备问题
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菌培养不好或失败
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抗性不对或菌已死
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核对抗性,尽可能提供载体信息。
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或菌培养条件特殊
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重新提供菌液,或提供2μg纯化质粒。
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质粒提不出
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质粒拷贝数极低或
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客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。
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培养方式不当
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质粒产量很低
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低拷贝数质粒或
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客户自己采取大量提取的方法提供2μg纯化质粒。
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培养方式不当
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自带质粒或已纯化PCR产物量极低
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是否为电泳法定量,
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质粒:电泳检测浓度大于100ng/ul,体积大于20ul。
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测OD值法不可靠,电泳检测
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总量是否足够
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已纯化PCR产物:根据片段长度提供足够量的模板,一般要求是100ng/反应/Kb,进行多个反应的应相应增加量。
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测序出现双峰或信号中断
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双峰
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重复序列,如polyT、polyA或几个碱基重复
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用反向引物测互补链。
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此类问题主要与样品有关
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质粒测序在插入序列中出现套峰
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可能是样品非单克隆,挑其他测序。
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PCR产物测序中,某一点后序列变乱
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可能是存在移码突变,这是正常的,也可以后测序。
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PCR产物中一个或多个位置有套峰
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序列中存在突变,这是正常的,也可以后进行测序。
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PCR产物测序前部分双峰
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引物二聚体污染或产物不纯,后测序。
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质粒测序时整个结果双峰
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引物特异性不好,序列中存在通用引物的同源序列;改用其他引物测序。
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质粒和PCR产物测序出现双峰
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引物不纯,测序时只要单一引物,请不要将双向PCR引物混合;合成的引物没有纯化,或纯化不好。重新合成引物测序。
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信号迅速衰减或中断
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模板GC二级结构区后
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难以得到好的测序结果,亚成较小的片段进行测序
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模板GT二级结构区后
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测反向互补序列,AC结构不影响测序
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严重的重复结构
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测反向互补序列
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模板特性决定的
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根据具体情况决定
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信号极弱或无信号
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模板质量差
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重新提供菌液或纯化PCR产物
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质粒样品:引物不符
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尽量提供载体详细信息,核查引物
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引物不适宜测序
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测序引物比PCR引物要求高,随机引物和简并引物不能用于测序,较长的PCR引物也不能用于测序。重新设计引物测序,对PCR产物而言建议到载体上用通用引物进行测序
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质粒产量极低
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客户自己提供2μg纯化好的质粒
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PCR产物定量极低
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重新电泳检测已纯化的PCR产物,确认有足够的量,或提供PCR原液由公司进行纯化
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测序结果正常,与预期不符
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找不到引物
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质粒模板
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检测是否为空载体,从其互补链上寻找,位点离测序引物太近,长插入片段未测通。
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PCR模板
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不可能找到所用的测序引物,短片段可以从互补链上找到另一段的引物,长片段由于测不通,无法找到相应序列想得到全序列,短片段可以从两端进行测序,长片段需要经后进行测序。
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结果完全不对
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请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
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