一、目的:

了解质粒抽提常用的方法和原理；掌握试剂盒制备质粒DNA 的法。

二、原理：

（一）质粒DNA 制备三个步骤：

1、细菌培养与质粒扩增

2、菌体收集和溶菌

3、质粒DNA分离

（二）方法介绍：

1、碱变性抽提法（SDS法）:主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。

质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。

缺点：SDS 破细胞很厉害，小染色体片段和蛋白质比较多，后处理较困难。

２、酸酚法：主要是利用染色体DNA和质粒DNA 在酸性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。

染色体DNA 分子量比较大，在酸性环境中（低pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。

质粒DNA 分子量小，在酸性环境中（低pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。

缺点： pH 值太低会降解DNA， pH 的适度难以掌握，稍一偏差，全部DNA 被降解，什么也没抽到。现不常用。

3、溴化乙锭-氯化铯（CsCl)梯度离心法:

1）不同的氯化铯浓度和不同的离心时间会成为不同的密度梯度。

2）抽提破细胞后，蛋白质，染色体DNA，质粒DNA,RNA 全部释放出来，加入溴化乙锭（EB)，通过EB对不同物质的插入多少而形成不同的密度梯度。EB插入越多,密度越小。离心后，在离心管中从上到下（密度由小到大）形成的梯度区域带如下：

↓

蛋白质（密度最小）

染色体DNA（机械剪切力的作用断裂成线状，EB插入较多，密度较小）

质粒DNA-线状（EB 插入较多，密度较小）

质粒DNA-环状（EB 插入较少，密度较大）

质粒DNA-超螺旋（EB 插入少，密度大）

RNA（单链，EB 插入最少，密度最大）

↑

不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl 密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA 与蛋白质区分开来

优点：此法抽提的质粒DNA 高纯度。

缺点：1）要求高档的超速离心机。

2）成本高，氯化铯价格贵。

4.TritonX-100 抽提法：

TritonX-100为非离子极性剂，在溶液中不形成离子，破细胞比较温和。使用该试剂是为了破细胞时不要太激烈，只形成孔状破裂，使质粒DNA 释出（当然还有RNA和一些小片段的染色体DNA 和蛋白质），而不释出大片段的染色体DNA 。当离心时染色体DNA的大片段与细胞膜的网状碎片附在一起，与蛋白质一起被离心沉淀，而质粒DNA则留在上清。所以细胞膜破裂的程度是实验的关键。

然后使用苯酚与氯仿来祛除蛋白质。用无水乙醇沉淀回收质DNA。

优点：抽提的质粒比较纯，较好用, TritonX-100 不影响后续实验，可以大量抽提。

缺点：比试剂盒抽提时间要长

三、试剂盒抽提法（本实验采用）:

（一）抽提原理:

人们使用碱与SDS裂解法从.E.coli 中分离制备质粒DNA 已经有20 多年的历史。将细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂（如NaOH和SDS）中，会使细胞壁破裂，染色体DNA 和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA 双链仍不会彼此分离，这因为他们在拓扑学上是相互缠绕的（超螺环结构）。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH 值恢复到中性时，DNA 双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被SDS 包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。

离心除去沉淀，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

早在20 世纪50 年代，人们就已经知道，在较低pH 值和高盐浓度环境下，DNA 能与硅胶（Silica gel）可逆结合。DNA双链与硅化材料相互作用的原理普遍认为是DNA分子中磷酸二酯键在较低pH 值和高盐浓度环境下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链的DNA分子一旦被硅胶吸附，则以天然状态或部分变性状态存在，不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大分子的溶剂（如70％乙醇）将其洗脱下来。但是，经过水溶性缓冲液（通常为TE或水）重新水化后，DNA 就能从层析柱上定量回收。

优点：快且纯。

（二）所用材料、试剂与器材:

1.高速离心机、微量移液器、1.5ml EP管

2.Rapid Plasmid DNA Daily Mini－prep Kit：

3.DNA－prep Tube（Silica 膜）

4.2ml Microfuge Tube

5.Buffer S1（葡萄糖维持渗透压、Tris－HCl 维持pH 值、EDTA 抑制核酸酶、RNaseA1降解RNA）

6.Buffer S2（NaOH裂解细胞与核酸变性、SDS裂解细胞与蛋白质变性）

7.Buffer S3（乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节pH 值）

8.BufferW1（乙酸钠洗脱蛋白质、糖类等大分子杂质）

9.BufferW2（70％乙醇洗脱盐离子）

10.Eluent（TE pH8.5 洗脱质粒DNA）

11.大肠杆菌C600（内含pUC18 质粒）

12. LB 完全培养基液（1%蛋白胨 0.5%酵母粉 0.5%NaCl pH7.5。）

（三）操作步骤与注意事项：

1.用接种棒取一环保存的大肠杆菌C600（内含pUC18 质粒）在LB 完全培养基斜面上接种，活化菌株。

2.在5 毫升LB培养液中，用微量进样器加入5微升氨苄青霉素溶液。同时接入已活化的大肠杆菌C600 一环，37℃援床培养过夜。

3.取100 微升氨苄青霉素溶液于100 毫升LB 培养液中，然后取1 毫升过夜培养物转接进去（1%接种量），37℃摇床培养过夜。

4.第二天分组用1.5ml EP 管收集细胞：将菌液10,000 rpm 离心1m，弃尽上清，重复一次，将管口倒置在纸巾上，轻轻敲击，使上清流出，管壁上不应有残留上清。

5.加入250μl BufferS1，涡旋，充分悬浮细菌沉淀。悬浮需充分，对光观察，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解。

6.加入250μl BufferS2，温和但充分地上下翻转4－6 次，此步骤不宜超过5m。避免剧烈混合，否则将导致基因组DNA 的污染。

7.加入400μl BufferS3，温和地上下翻转10－20 次，直至沉淀由疏松状态变为相对紧密，体积明显缩小为止，室温静置2m。12,000rpm 离心10m。避免剧烈混合，否则将导致基因组DNA 的污染。若离心后凝结块未沉淀沉淀到管底部，应再次翻转混合数次，12,000rpm离心3m。