溶液配制

（一）LB培养基

每1000 ml加分析纯NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，用ddH₂O配制，再用10 M NaOH调pH至7.4（100 ml一般加450 μl），高温高压蒸汽灭菌15 min冷却后使用。

固体培养基加入琼脂1.5%。

10 M（或N）NaOH配制方法是称200 g NaOH加300 ml，搅拌充分溶解后定容至500 ml。

（二）溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

溶液Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH至8.0。可一次配制100 ml，在1.05 kg/cm²高温高压蒸汽灭菌15 min，4℃保存。

溶液Ⅱ：NaOH 0.2 mol/L（从10 N NaOH中现用稀释），SDS 1%，用现配现用。

溶液Ⅲ：取5 mol/L乙酸钾 60 ml，冰乙酸11.5 ml，混合后ddH2O至100 ml。保存于4℃，用时置于冰浴中。

1 M Tris-HCl（pH 7.5）配制方法：Tris（MW 12.1）12.1 g 加浓HCl（MW 36.5）72 ml，调节pH到7.5并定容到1000 ml。1 M Tris-HCl（pH 8.0）配制方法：12.1 g Tris加800 ml ddH₂O，用HCl（~42 ml）调pH到8.0。等溶液在室温下冷却，最后调节pH到8.0并定容到1000 ml。高温高压蒸汽灭菌。

（三）酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）

按25:24:1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃保存备用。酚-氯仿-异戊醇混合物在100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）缓冲液下在不透光的瓶中可保存一个月之久。

（四）TE（pH 8.0）

10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA（pH 8.0），加ddH₂O至1000 ml。高温高压蒸汽灭菌。或用100×TE母液稀释。

（五）STE

10 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.1 M NaOH，1 mM EDTA（pH 8.0），加ddH₂O至1000 ml。高温高压蒸汽灭菌。

小提质粒（碱裂解法）

1、从平板上挑取单菌落或摇甘油菌（5~50 μl），接种于3 ml的LB液体培养基中（加于相应的抗生素），37℃振荡培养至OD₆₀₀ 大于2.0，无需过夜。

通常DH5a菌株摇12~16 hr；JM101摇7~8 hr；ER2566摇10~12 hr。

2、取1.5 ml的菌液于1.5 ml的Eppendorf管（可取未灭菌的新管）中，12000 rpm离心30 sec，弃上清。通常取1.5 ml的菌液再离心一次，弃上清后在纸上扣干。不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理。

3、加入100 μl溶液Ⅰ振荡使菌体沉淀充分悬浮，务必悬浮充分。

4、加入200 μl溶液Ⅱ，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。可观察到原浑浊的菌悬浮液变清变粘。

5、加入150 μl溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7-10次，不宜太剧烈。可观察到白色片状沉淀出现。

6、置冰浴10 min，也可置于－20℃中5 min。

7、12000 rpm离心8~10 min。

8、在离心过程中可取未灭菌的新1.5 ml的Eppendorf管，加入等体积（350~400 μl即可）酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）备用，取灭菌的新1.5 ml的Eppendorf管，加入2倍体积（780 μl体积即可）的无水乙醇于－20℃备用。加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层的Tris-Cl保护液。

9、离心完将上清迅速倒入已加的酚-氯仿-异戊醇中，充分混匀。小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中。

10、12000 rpm离心4~5 min。

11、吸水相，加入已加好的无水乙醇中，颠倒混匀几次。小心不要吸入酚相，没把握时宁可放弃一些水相。

15、置于恒温器上干燥（55℃）至无色透明或无乙醇气味，大至要5~10 min。

16、加入30~40 μl 1×TE缓冲液溶解沉淀，－20℃储存备用。

小量快提质粒鉴定

1、取培养的菌液1 ml，12000 rpm离心30 sec，收集菌体，在纸上扣干残留培养液。

2、用50 μl无菌水充分悬浮菌体。

3、每管加入50 μl酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）并充分混匀。

4、12000 rpm离心10 min。

5、小心吸取50 μl上清电泳（对于插入片4足够大的重组子，其迁移率应低于未插入片段的对照质粒）。

大提质粒

1、从－20℃保存的甘油菌吸取50 μl菌液，接种到3~4 ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀大于1.6~1.8。

2、取0.5 ml的菌液于200 ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀大于2.0以上。再加入氯霉素至170 µg/ml，37℃振荡培养摇12~16 hr。

3、用摇好的菌液4000 rpm离心15 min。

4、弃上清，敞开管口，倒置，尽量让上清全部流尽。

5、用预冷的40 ml STE充分悬浮菌体沉淀。

6、4℃，4000 rpm离心15 min。

7、弃上清，敞开管口，倒置，让上清全部流尽。

8、用预冷的4 ml溶液Ⅰ充分悬浮菌体沉淀。

9、加入新鲜配制的8 ml溶液Ⅱ，上下颠倒数次，液体变得澄清，置于4℃10 min。

10、加入预冷的溶液Ⅲ 6 ml，上下颠倒充分混匀后，于4℃中放置10 min。

11、4℃，12000 rpm离心10 min。

12、收集上清，加等体积的异丙醇，4℃中放置30 min。

13、4℃，10000 rpm离心10 min。

14、弃上清，用适量的70%的乙醇洗沉淀一次，室温吹干，溶于1 ml 1×TE中。

15、加50 μl RNase A，37℃作用2 hr。

16、加入1 ml新配制的13% PEG8000溶液（13% PEG8000，1.6 M NaCl），充分混匀，4℃中放置30 min。

17、4℃，12000 rpm离心15 min。

18、吸去上清，用400 μl 1×TE缓冲液溶解沉淀。

19、加1/4体积4 M LiCl，室温下放置5 min，12000 rpm离心5 min。

20、取上清，用酚、酚-氯仿-异戊醇各抽提一次。

21、将水相转入一新的Eppendorf管中，加入1/10体积4 M LiCl，2倍体积的无水乙醇，－20℃下放置30 min。

22、4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清，70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干。

23、加200 μl 1×TE缓冲液溶解沉淀，测定质粒DNA 的浓度后于－20℃储存备用。