适合从动物细胞、动物组织或酵母菌中同步纯化总RNA 和基因组DNA纯化的总RNA ，适合用于Northern Blot、RT-PCR、体外翻译、Primer Extension、S1 核酸酶作图、RNase 保护测定、制备mRNA 和构建cDNA 文库等各种RNA 分子生物学实验。

纯化的基因组DNA 适用于PCR、Southern Blot、RAPD、AFLP、RFLP 等分子生物学实验。

一、试剂盒组成、贮存、稳定性

以每次从1×10⁷ 动物细胞、100mg 动物组织或5×10⁷ 酵母菌中提取总RNA 和基因组DNA 为一次制备。

本试剂盒所有试剂在室温贮存2 年不影响使用效果。

Buffer R-A：细胞裂解液，室温密闭贮存。

Buffer R-B：蛋白质变性剂，室温密闭贮。

Buffer R-C：分相溶液，室温密闭贮存。

Buffer R-D：分相溶液，室温密闭贮存。

Buffer R-E：RNA 释放溶液，使用前检查溶液是否有沉淀析出，如有沉淀请于37℃温育溶解后再使用。

室温密闭贮存。

RNase-free Water：RNA 溶解溶液，室温密闭贮存。

Buffer TE：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.5，RNase-free。RNA 溶解溶液，室温密闭贮存。

Buffer G-A：裂解液，溶解蛋白质-基因组DNA 复合物，释放基因组DNA。室温密闭贮存。

Buffer G-B：蛋白质变性剂，室温密闭贮存。

Buffer P2：分相溶液，室温密闭贮存。

Buffer B：DNA 结合溶液，室温密闭贮存。

Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。

Buffer W2：脱盐液，使用前按试剂瓶上指定体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。

Eluent：2.5mM Tris-HCl, pH8.5。DNA 洗脱溶液，室温密闭贮存。

二、简介

总RNA 和基因组DNA 同步纯化试剂盒是为从生物样品中同步纯化总RNA 和基因组DNA 设计的，可从≤1×10⁷ 动物细胞、100mg 动物组织或5×10⁷ 酵母菌中提取多至150μg RNA 和20μg DNA。

本试剂盒采用全新的相分离技术分离、纯化RNA 和DNA，结合silica 膜选择性吸附DNA 的原理，达到快速、同步纯化RNA 和基因组DNA 的目的。本试剂盒纯化的总RNA 分子完整、纯度高，适合用于NorthernBlot、RT-PCR、体外翻译、Primer Extension、S1核酸酶作图、RNase 保护测定、制备mRNA 和构建cDNA 文库等各种RNA 分子生物学实验。纯化的基因组DNA 长度介于30～150kb之间，适用于PCR、Southern Blot、RAPD、AFLP、RFLP 等分子生物学实验。

三、原理

1. 细胞裂解、释放总RNA含高浓度胍盐的Buffer R-A 迅速裂解细胞和细胞核，匀浆过程中基因组DNA 被剪切成相对较小的片段，降低溶液的粘稠性，促使释放RNA。Buffer R-B 有效地变性蛋白质，使之与基因组DNA 形成紧密的不溶性复合物，而保持RNA 分子的游离性，确保最大程度地释放RNA。

2. 相分离技术分离、纯化RNA 和DNA

不同于酚/氯仿抽提，本公司独创的相分离技术所形成的两相溶液体系中，上相为亲脂性有机相，下相为特定的饱和无机盐溶液形成的疏水环境。各种生物分子因其不同的理化特性而被分离开来：脂溶性成分（包括脂质、脂多糖、多糖、细胞代谢产物和色素）被分配到上相；长链状的基因组DNA 和蛋白质形成复合物沉淀在相间，被剪切成小片断的基因组DNA(<150bp)则被分配在下相中；根据不同分离目的采用不同的相分配体系，可使RNA 分配在下相中或选择性地沉淀在离心管底。本试剂盒采用了这几种不同的相分离体系来分离、纯化RNA 和DNA。

（1）在Buffer R-C 驱动下，RNA 被分配在下相中，基因组DNA 和蛋白质形成复合物沉淀在相间。分离下相和相间沉淀分别作RNA 和基因组DNA 纯化。

（2）在分离到的下相中加Buffer R-D 进行相分离，将RNA 选择性地沉淀到管底，经50%乙醇洗涤后即可用于RT-PCR、NorthernBlot、制备mRNA 和构建cDNA 文库等实验。

（3）在分离到的相间沉淀中加Buffer G-A 释放DNA，加Buffer G-B 变性蛋白质，再加Buffer P2 进行相分离，将DNA 分配到下相。

3. Silica 膜选择性结合DNA

在DNA-prep Tube 中整合有silica 膜，对DNA 有高盐结合低盐洗脱的特性。含DNA 的下相在加入结合溶液（Buffer B）调整溶液的离子条件和pH 条件后，DNA 可被选择性结合到silica 膜上，经洗涤进一步去除杂质后，DNA 可被微量去离子水或Eluent 洗脱下来。

4. 保持RNA 分子完整性

RNA 分子对RNA 酶和理化因素非常敏感。Buffer R-A 在裂解细胞和细胞核的同时迅速灭活RNA 酶，其他溶液均能强烈抑制RNA 酶活性，从而避免了RNA 酶的降解作用；相分离过程均在低温、近中性溶液中进行，减少了理化因素对RNA 分子造成的损伤，从而保证了RNA 分子的完整性。

四、操作过程

在总RNA 和基因组DNA 同步纯化过程中要注意防止RNA 的降解。迅速抑制或灭活内源性RNA 酶，避免外源性RNA 酶污染，抑制理化因素对RNA 的降解，是提取完整RNA 分子的重要前提。

1. 样品收集

样品在分离后短时间内，细胞内的RNA 酶即被释放、激活，或者RNA 去保护暴露酶作用位点，导致大部分RNA 降解。建议收集新鲜的样品立即作总RNA 和基因组DNA 提取，或用液氮冷冻，置-80℃保存，以防止RNA 在提取前降解。

（1）培养的动物细胞

从对数生长期细胞中提取的RNA 和基因组DNA 质量好、得率高，故用于提取总RNA 和基因组DNA 的细胞密度不宜超过85%，最好在提取前一天更换培养基。但有的基因是在特定的生长状态或激活状态下达到最适表达，故提取RNA 和基因组DNA 所需的细胞状态还需根据具体实验目的而定。

细胞在收集后应立即作RNA 和基因组DNA 提取或将收集管浸入液氮中冷冻完全后置-80℃保存。

（2）动物组织

动物组织分离后，立即置冰上剪切成0.5cm 大小的组织块，浸入液氮中。冷冻完全后，立即作RNA 和基因组DNA 提取或置-80℃保存。脾脏、胸腺和淋巴结等富含RNA 酶的组织宜先用温和的方法分离成单细胞悬液再作总RNA 和基因组DNA 提取。

（3）酵母菌

收集对数生长期酵母菌，立即作RNA 和基因组DNA 提取。

2. 估算样品大小

可通过以下方法估算样品大小：

（1）培养的动物细胞：可根据表1 估算培养器中的细胞数量。

（2）动物组织：称取动物组织重量。

（3）酵母菌：培养液中细胞浓度可用分光光度计来检测：将培养液稀释至OD600 为0.05～0.3 之间，按0.1

OD600 相当于3×106 细胞/ml 的比例计算细胞浓度。比如，培养液稀释4 倍后OD600 为0.25，则该培养液的浓度为3×107 细胞/ml。

3. 决定起始样品大小

本试剂盒起始样品不能超过1×107 动物细胞、100 mg 动物组织或5×107 酵母菌，该限制主要来自以下两方面原因：

（1）系统最大负荷的限制：过多增加起始样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA 和蛋白质所占比例增大，使RNA 不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA 沉淀效率。

（2）DNA-prep Tube 最大结合能力的限制：DNA-prep Tube 中整合的silica 膜最多能结合30 μg DNA，剩余的DNA 因不能结合到silica 膜上而丢失。另外，若样品量太小，不影响提取DNA，但会造成RNA过分稀释而不能被有效地沉。此时，需按比例减少抽提溶液的体积，以提高沉淀RNA 的效率；请参考表2，根据起始样品大小决定抽提溶液体积。

4. 样品匀浆

匀浆充分与否是决定总RNA 和基因组DNA 得率的关键。匀浆前，动物组织用液氮碾磨分散细胞，酵母菌需酶解制备成原生质体或用液氮碾磨破坏细胞壁，以提高裂解效率。动物细胞可直接进行匀浆。匀浆时用带4～6 号针头的1 ml 注射器反复快速吸注溶液，将基因组DNA 剪切成相对较小的片段，以降低溶液的粘稠性。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。

5. 沉淀蛋白质与基因组DNA

在匀浆中加入Buffer R-B，促使蛋白质发生变性凝集并与基因组DNA 形成紧实的不溶性复合物。若匀浆不充分，溶液仍很粘稠，此时大部分RNA 将被不溶性复合物包裹而丢失。

6. 相分离技术分离RNA 和DNA

在Buffer R-C 驱动的相分离过程中，RNA 被分配在下相；基因组DNA-蛋白质复合物沉淀在相间。分离下相和相间沉淀分别作RNA 纯化（见操作过程7）和基因组DNA 纯化（见操作过程8）。

7. 纯化RNA

吸取下相时，偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见图1） 

若起始样品是动物组织，可能有不溶性物质沉淀在管底。吸取下相时，勿吸入管底沉淀。因为在后续的相分离过程中，这些不溶性物质将和RNA 一起沉淀在管底，不能被去除干净。

在分离到的下相中加Buffer R-D 进行相分离将RNA 选择性地沉淀到管底，经50%乙醇洗涤后即可用于RT-PCR、Northern Blot、制备mRNA 和构建cDNA 文库等实验。或者用Buffer R-A 溶解RNA 沉淀，再用异丙醇沉淀，彻底去除盐份。

8. 纯化DNA

彻底去除上相和下相溶液，保留相间沉淀，加Buffer G-A 溶解沉淀释放DNA。在Buffer G-B 变性蛋白质后，加入Buffer P2 将DNA 分配到下相。吸弃上相，将下相转入Filter。吸取下相时，偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见图2）：

离心过滤，在滤液中加Buffer B 调整DNA 结合条件。将溶液转入DNA-prep Tube，离心过滤使 DNA选择性地结合到silica 膜上，经洗涤进一步去除杂质后，DNA 可被微量去离子水或Eluent 洗脱下来。

9. RNA 和DNA 保存

RNA 对理化因数非常敏感，应以乙醇盐沉淀的形式或溶于Buffer TE，置-20℃以下保存。基因组DNA置-20℃保存。

五、注意事项

1.Buffer R-A 和BufferG-A 含有刺激性胍盐，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染到皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤或眼睛，立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询或治疗。

2.在提取总RNA 的操作过程中，要始终戴一次性乳胶手套，使用RNase-freeTip 头和微量离心管，以避免RNA酶污染。

3.建议设置RNA 专门工作场所，应避免在DNA 工作场所（经常使用 RNA 酶）做提取RNA 工作。

4.建议使用RNA 专用分析仪器设备，如电泳槽、微量加样器等。

六、实验准备

从所有样品中提取总RNA 和基因组DNA 都需做如下准备：

1.RNase-free 的Tip 头、1.5 ml 离心管、带4～6 号针头的1 ml 注射器。

2.4℃预冷Buffer R-A、Buffer R-B、Buffer R-C 和Buffer R-D。

3.65℃预热Buffer G-A、Eluent 或去离子水。

4.检查Buffer R-E 是否出现沉淀，若有沉淀请于37℃温育至沉淀完全溶解。

5.检查Buffer G-A 和BufferG-B 是否出现沉淀，若有沉淀于65℃温育直至沉淀完全溶解。溶解沉淀后不必恢复至室温，可直接用于实验。

6.第一次使用时，在Buffer W2 中按试剂瓶上指定得体积加入无水乙醇。

7.异丙醇。

8.50%乙醇，4℃预冷。

9.冰水浴和65℃水浴。

10.将离心机预冷至4℃；纯化基因组DNA 时将离心机恢复至室温。

从各种样品中提取总RNA 和基因组DNA 需准备事项如下：

（一）从动物细胞中提取总RNA 和基因组DNA

从培养的贴壁动物细胞中提取总RNA 需配制PBS 或不含血清的培养基。室温密闭贮存，使用前4℃预冷。

PBS：1.44 g Na₂HPO₄·2H₂O(或1.15 g Na₂HPO₄), 0.2 g KH₂PO₄, 0.2 g KCl, 8.0 g NaCl，加水至1升，调节pH 至7.2，高压灭菌。

（二）从动物组织中提取总RNA 和基因组DNA

液氮、研钵和研棒。

（三）从酵母菌中提取总RNA 和基因组DNA

1.用酶法需作如下准备：

（1）配制酵母菌原生质体制备缓冲液：

1 M 山梨醇, 0.1 M EDTA, pH 7.4。使用前加β-巯基乙醇至终浓度为0.1 %，按70 U / 1×107 细胞的比例加入Lyticase。

（2）30℃水浴。

2.用研磨法需准备液氮、研钵和研棒

七、操作步骤

以下是以1×107 动物细胞、100 mg 动物组织或5×107 酵母菌为例的总RNA 和基因组DNA 提取方法。

从其他大小的样品中提取总RNA 和基因组DNA 时，参考表2 调整抽提溶液体积。

表2：起始样品大小和相应的抽提溶液体积

[分离RNA 和基因组DNA]

1. 样品收集和匀浆

[动物细胞]

从对数生长期细胞中提取的RNA 和DNA 质量好、得率高，所以细胞密度不宜超过85%，最好在提取前一天更换培养基。但有的基因在特定的生长状态或激活状态下达到最适表达，故实验所需的细胞状态还需根据具体实验目的而定。

A.悬浮培养的动物细胞或新鲜分离的动物组织单细胞悬液从脾脏、淋巴结和胸腺等富含RNA 酶的组织中提取RNA 和DNA 时，宜用温和的方法将之分离成单细胞悬液。

（1）取1×10⁷细胞，4℃，1200×g 离心5min，弃尽上清。

（2）加0.45ml 4℃预冷的BufferR-A，立即用带4～6号针头的1ml 注射器反复吸注10次。

匀浆充分与否是决定RNA和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。

B.贴壁培养的动物细胞

（1）将含1×10⁷细胞的培养器皿置冰上，吸尽培养基。加5ml 4℃预冷的PBS 或不含血清的培养基洗涤细胞，尽量吸尽洗涤液，并避免用力吹打细胞。

（2）加0.45ml 4℃预冷的Buffer R-A，使之遍及细胞层，用细胞刮刀将匀浆收集到培养器皿一侧，吸取匀浆转1.5ml 离心管。

（3）用带4～6号针头的1ml 注射器反复吸注10次。

匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。

[动物组织]

（1）动物组织分离后，立即置冰上剪切成0.5cm 大小的组织块，浸入液氮中。

操作必须迅速，以防止RNA 在提取前降解；若暂时不作提取，冷冻完全后置-80℃冰箱中保存。

（2）称取100mg 冷冻完全的组织块，放入研钵中，边碾磨边加液氮（防止样品融化），直至将样品碾磨成粉末状。

（3）加0.45ml 4℃预冷的Buffer R-A，迅速用力碾磨至Buffer R-A 完全融化，继续碾磨30sec。

（4）将匀浆转入1.5 ml 离心管。如匀浆残留较多，加100μl Buffer R-A，适当研磨后，收集合并到1.5ml 离心管。

（5）用带4～6 号针头的1ml 注射器反复吸注10次。

匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。

[酵母菌]

（1）取5×107对数生长期酵母菌，10000×g 离心20sec ，弃尽上清。

（2）破壁和匀浆

用户可选择酶法或碾磨法破坏细胞壁。酶法是用Lyticase 消化细胞壁，将酵母菌制成原生质体。

碾磨法是用机械力破坏细胞壁。两种方法在RNA 的纯度和得率上无任何差别。

A.酶法

（a）用1ml 已加入70U Lyticase 的酵母菌原生质体制备缓冲液悬浮酵母菌沉淀，30℃温育10～30min。

（b）4℃，3000×g 离心5min，弃尽上清。

（c）加0.45ml 4℃预冷的Buffer R-A，立即用带4～6号针头的1ml 注射器反复吸注10次。

匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。

B.碾磨法

（a）用100μl 去离子水悬浮沉淀，转入研钵，加入液氮，待酵母菌冷冻完全后，快速用力碾磨1min

（边加液氮边碾磨，防止样品融化）。

（b）加0.45ml 4℃预冷的Buffer R-A，迅速用力碾磨至Buffer R-A 完全融化，继续碾磨30sec。

（c）将匀浆转入1.5ml 离心管，如有较多匀浆残留在研钵中，加100μl Buffer R-A，适当匀浆后收集合并到1.5ml 离心管。

（d）用带4～6 号针头的1ml 注射器反复吸注10次。

匀浆充分与否是决定RNA 和DNA 得率的关键。匀浆完全时，溶液不再粘稠，很容易从注射器针头上呈不连续滴状滴落，而非连续状。

2.吸取0.4ml 匀浆液转入另一1.5 ml 离心管中，若匀浆体积不足 0.4ml，加Buffer R-A 补充至0.4ml。

3.加0.15ml Buffer R-E，盖紧离心管，旋涡振荡混合均匀或或用步骤1 中使用的注射器反复吸注2～3次。

4.加0.45ml 4℃预冷的Buffer R-B，盖紧离心管，用力上下混合均匀。

5.加0.45ml 4℃预冷的Buffer R-C，盖紧离心管，用力上下混合均匀，冰浴5min

6.4℃，≥12000×g 离心5min。

离心后溶液分相：RNA和游离DNA位于下相；脂质、多糖和色素位于蓝色上相；蛋白质与基因组DNA复合物形成相间沉淀；若起始样品是动物组织，可能有肉眼可见的不溶性物质沉淀在管底。

7.吸取0.8ml下相溶液，转移至另一离心管中，按 [A.纯化RNA]进行操作。吸弃原离心管中上相和下相溶液，保留相间沉淀，按[B. 纯化基因组DNA]进行操作。

分离下相时勿吸取管底沉淀，偶有混入的上相，可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见图1）。

[A. 纯化RNA]

A8.在分离到的下相中加0.65ml 4℃预冷的Buffer R-D，盖紧离心管，用力上下混合均匀，冰浴5min。

若样品是≤2×10⁵ 细胞、≤2mg 动物细胞或RNA 含量低的样品，在步骤A8中冰浴10min，在步骤A9中离心时间延长至20～30min。

分离的下相的体积与Buffer R-D 的体积比为16:13。

A9.4℃，≥12000×g 离心10min 将RNA 沉淀于管底。

离心后溶液分相：游离DNA 位于下相，残留的蛋白质变性析出形成相间沉淀，RNA 沉淀于离心管底。

A10.倒置离心管稍用力甩弃或用Tip头吸弃液相和相间沉淀；简短离心，仔细吸尽残余液体。

必须将液相和相间沉淀去除干净，否则会影响RNA 纯度。

吸走液相时，仔细观察RNA 沉淀，勿将RNA 沉淀吸走。

A11.RNA 沉淀洗涤

若提取的RNA 用于RT-PCR、Northern Blot、制备mRNA 和构建cDNA 文库，可省略步骤（1）和步骤（2），直接按照步骤（3），用50%乙醇简单洗涤RNA 沉积块。

（1）加100μl Buffer R-A 和100μl RNase-free Water，旋涡振荡或用Tip头反复吹吸充分溶解沉淀。

（2）加160μl 异丙醇，混合均匀，4℃，≥12000×g 离心5min； 弃尽上清。

（3）加0.5ml 4℃预冷的50%乙醇， 倒置离心管丢弃液相；简短离心，仔细吸尽残余液体。置空气中将乙醇挥发除尽。

若需长期保存RNA，可将乙醇沉淀形式的RNA 置-20℃保存。使用前按照步骤A12～A13 操作溶解RNA。

A12.加50～200μl Buffer TE 充分溶解RNA 沉淀，4℃，≥12000×g 离心2min。

可根据RNA沉积块大小和RNA 使用浓度来决定Buffer TE 的体积。

A13.将上清转移到RNase-free的离心管，置-20℃以下保存。

[B.纯化基因组DNA]

B8.在分离到的相间沉淀中加0.4ml 65℃预热的Buffer G-A，用1ml Tip 头快速吹打10次或旋涡振荡15sec，65℃温育5min。

B9.加0.4ml Buffer G-B，旋涡振荡15sec。

B10.加0.65ml Buffer P2，用力混合均匀，12000×g 离心1 min。

离心后溶液分相，蛋白质沉淀在相间，DNA 被分配在下相。

B11.将Filter 置于洁净的1.5ml 离心管中。吸弃上相，将下相转入Filter，12000×g 离心1min。

上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相,可在Tip 头内迅速分相，便于丢弃（见图2）。

务必除尽上相，否则将抑制DNA 结合到silica 膜上。

如在转移过程中吸入少量相间沉淀，可在过滤时去除。

B12.弃Filter，在滤液中加入0.45ml Buffer B，混合均匀。

B13.将DNA-prep Tube 置于2-ml Microfuge Tube 中，将步骤B12中的混合液移入DNA-prep Tube 中，2500×g 离心1min。

如在DNA-prep Tube 中仍残留溶液，适当升高离心速度，再次离心，使所有溶液过滤到2-ml Microfuge Tube中。

B14.弃滤液，将DNA-prep Tube 置回2-ml Microfuge Tube 中，加入0.5ml Buffer W1，2500×g 离心1min。

如在DNA-prep Tube 中仍残留溶液，适当升高离心速度，再次离心，使所有溶液过滤到2-ml Microfuge Tube中。

B15.弃滤液，将DNA-prep Tube 置回2-ml Microfuge Tube 中，加入0.7ml 已加无水乙醇的Buffer W2，2500×g 离心1min。以同样的方法再用0.7ml Buffer W2 洗涤一次。

确认在Buffer W2 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

B16.将DNA-prep Tube 置于1.5ml 离心管中，12000×g 离心1min。

B17.将DNA-prep Tube 置于另一洁净的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入6μl 65℃预热的Eluent或去离子水，室温静置1min。12000×g 离心1min 洗脱DNA。

1.收集样品。

2.匀浆。

3.补充Buffer R-A 至0.4ml。

4.加0.15ml Buffer R-E。

5.加0.45ml Buffer R-B。

6.加0.45ml Buffer R-C。

A7.分离0.8ml 下相，加0.65ml Buffer R-D 沉淀RNA。

A8.加100μl Buffer R-A 和100μl RNase-free Water溶解RNA。

A9.加160μl 异丙醇沉淀RNA。

A10.加0.5ml 50%乙醇洗涤沉淀。

A11.加50～200μl Buffer TE 溶解RNA。

B7.分离相间沉淀，加0.4ml Buffer G-A 溶解沉淀。

B8.加0.4ml Buffer G-B。

B9.加0.65ml Buffer P2。

B10.分离下相，转入Filter。

B11.加0.45ml Buffer B。

B12.溶液转入DNA-prep Tube。

B13.加0.5ml Buffer W1 洗涤。

B14.加0.7ml Buffer W2 洗涤，重复Buffer W2 洗涤。

B15.离心除尽乙醇。

B16.加60μl Eluent 或去离子水洗脱。

九、常见问题分析

[纯化RNA 时的常见问题]

1.无RNA 沉淀

（1）匀浆不完全：匀浆不完全时，基因组DNA分子仍然很大，溶液粘稠。加入Buffer R-B 后，变性的蛋白质和基因组DNA 一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。

（2）沉淀不完全：从小于≤2×10⁵ 动物细胞、≤2mg 动物组织或RNA含量低的样品中提取RNA 时，匀浆体积太大，将造成RNA 过分稀释而不能有效地沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时，应按比例减少抽提溶液，在加Buffer R-D后延长冰浴和离心时间，具体实验参数见相应操作步骤。

2.RNA回收率偏低

（1）系统超负荷：如果过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA 和蛋白质所占比例增大，使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA沉淀效率。

（2）匀浆不完全：匀浆不完全时，RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹，不能被有效释放。

（3）沉淀未有效溶解：未完全溶解RNA 沉淀，未溶解的RNA 丢失。

（4）样品未及时处理或细胞生长过度：样品分离后短时间内细胞内RNA 酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内RNA 酶，若不及时提取RNA，大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA 提取，应立即用液氮冷冻完全，置-80℃贮存。

3.RNA难溶解

（1）相分离不完全：两次相分离过程均需在低温下进行，预冷抽提溶液、冰浴和4℃离心是必需的。另外，Buffer R-C 驱动的相分离过程中，长时间离心也是去除不溶性杂质必需的。

（2）Buffer R-C驱动相分离后，吸取下相时带入不溶性沉淀物；这些不溶性物质在Buffer R-D驱动的相分离过程中和RNA 一起沉淀下来，降低RNA 溶解性。

4.RNA降解

（1）组织分离后未经液氮冷冻完全即进行总RNA提取或贮存。

（2）液氮碾磨过程中未及时添加液氮，样品融化，细胞中释放的RNA酶降解RNA。

（3）匀浆不充分：组织或细胞成分未完全分散，样品中RNA 酶未完全灭活。

（4）相间沉淀未弃尽：在加入Buffer R-D进行相分离后，应弃尽液相和相间沉淀。否则，相间沉淀中残留的RNA 酶在溶解后导致RNA 的降解。

（5）Tip头、离心管、贮存管受RNA酶污染。

（6）RNA在水溶液中呈酸性，易自发水解，所以RNA应溶于Buffer TE 中，-20℃以下保存。

[纯化基因组DNA 时的常见问题]

1.基因组DNA 降解

（1）样品不新鲜：虽然DNA 在分子结构上较RNA稳定，但样品在分离后细胞内的DNA 酶同样会作用于DNA分子。

（2）样品本身富含DNA酶：处理这样的样品，宜用Buffer W1洗涤两次。

2. 得率低或无基因组DNA

（1）DNA未充分释放：在分离到的相间沉淀中加Buffer G-A后未充分振荡释放DNA。

（2）Buffer W2中未加入无水乙醇：未加乙醇的Buffer W2是一种低盐溶液，可溶解DNA。若直接用于洗涤DNA-prep Tube 将会溶解并去除结合在silica膜上的DNA。

（3）DNA 未充分洗脱：用于洗脱DNA的Eluent或去离子水应在使用前预热至65℃，其体积不应小于60μl。

3.RNA污染

在Buffer R-C 分相后分离相间沉淀的时，未将下相（含RNA）完全去除。

4.生物学活性差

（1）DNA 中盐分含量高：Buffer W1含高浓度盐离子，后续的Buffer W2 洗涤是为去除盐分设计的。操作时按说明书指定的参数用Buffer W2洗涤DNA-prep Tube。

（2）DNA 中含乙醇：使用前用户已在Buffer W2中加入乙醇，若洗涤时不严格按照说明书提供的实验参数进行操作可能会有乙醇残留在silica 膜上。