在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。
　　Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

　　现行的逻终止法人加减法序列测定技术（Sacger和Coulson，1975）发展而来的。加减法首次引入了使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长度差一个核苷酸的单链DAN等3种方法。尽管有了这些进展，但加减法仍然太不精确，也太不得法，因此难以广为接受。直至引入双氧核苷三磷酸（ddTBP）作为链终止剂（Sanger等，1977 ），酶法DNA序列测定技术才得到广泛应用。2'，3'ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3' 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5' 三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3'羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP后， 链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。

１．引物
　　酶促测序反应中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。在许多情况下，可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取得单链DNA分子作为模板。但也可以采用Sanger 法商定变性双链DNA模板的序列。在以上两种情况下， 都可以采用能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，而不必取得与未知DNA序列互补的引物。适于M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15-29 个核苷酸，并可与紧靠M13mp18噬菌体多克隆位点区的HindⅢ位点成M13mp19 噬菌体多克隆位点区的EcoRI位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行“双链”测序，并可从许多厂商中购置得到。此外，还有若干家公司出售一些引物，这些引物下为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。
２．模板
　　如上所述，有两类DNA可以用作Sanger 法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用通常从重组M13噬菌体颗粒中分离得到的单链DNA应中获得数百个核苷酸的序列。如用变性双链DNA用模板，则较难获得这咱质量的结果。尽管采用双链DNA模板的方法显然既简单又方便（Chen和Seeburg，1985），然而只是在不久前得到改进以后， 这一方法才发展到能够获得明确可信结果的水平。其中有两个因素是至关重要的，这就是模板DNA的质量和所用DNA聚合酶的种类。小量制箅的质粒DNA常常被寡脱氧核糖核苷酸小分子、核糖苷酸及DNA聚合酶的抑制剂所污染，其中前两种污染物可被用作随机引物。结果，种种“鬼”带、强终止现象，以及其他假象往往使测序凝胶含混不清、黯然失色。因此采用小量制备的质粒NDA来测定未知DNA克隆片段的序列，并不可取。然而,这类DNA常可作为对已经通过另一方法测定的序列进行进一步的合适模板。采用CsCl－溴化乙锭梯度平衡离心法来纯化质粒DNA，测序的结果会好得多，但却要耗费大量的人务和物力。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。
３．DNA聚合酶
　　通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（Sanger等，1977），反转录酶（见文献，如Mieredorf和Prfeffer，1987）经过修饰消除了3'→5'外节酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶（Sequenase）和测序酶2.0），Tabor和Richardson，1978]惟及从嗜热水生菌（T'hermus aquaticus）分离的耐热DNA聚合物（Taq DNA聚合酶）。这些酶的特性差别悬殊，因而可大大影响通过链终止反应所获得的DNA序列的数量的质量。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow 片段 这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶。 通常碰到的两个问题是：1）Koenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于dd NTP的掺入，而是因为聚合酸人模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能沿模板进行长中距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。通常，这一反应只能得到大约250-350个核苷酸的序列。 如果分两步进行反应，所得序列的数目可以翻一番；其中第一步是初始标记步骤，采用低浓度的dNTP，而随后的第二步是链延伸－链终止反应，含有ddNTP和高浓度的dNTP（Johoston-Dow等，1987;Stambaugh和Blakesley，1988）。然而即使有了这些改进，用Klenow 酶所测序列的长度通常还是不如持续合成能力较强的测序酶。2）这种酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题（Gomer和Firtel，1985)。有时可采用一些dNTP类似物[如dITP或7－脱氮dGTP（7－deaza-dGTP）]来获取模板中可形成稳定二级结构的相应区段的序列信息，但Kleow酶对这些类似物的作用不如测序酶有效，这也许是因为它们使Klenow酶原已较低的持续合成能力进一步降低。总而言这，可以选用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段测定从引物5'位置起250个碱基以内的一段DNA序列， 但不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。
（2）反转录酶 尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶解决一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。来自禽类和鼠类反转录病毒的反转录酶在这一看来要比Klenow酶略胜一筹（Karanthaansis，1982;Graham等,1986 ）,尽管它们也许还是比测序酶逊色（Cameron-Mills，1988;Revak等1988）。
（3）测序酶: 测序酶（SequenaseTM）是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。这酶原来具有很强的3'→5'外切核酸活性，经过修饰后， 这一活性大部分均被消除。测序酶2.0版是测序酶的基因工程产品，它完全缺失了3' →5'外切核酸酶活性，极其稳定而经活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，对诸如dITP和7－脱氮－dGTP等用于提高分子辨率使测序凝胶某些区段上的压缩条带得以分开的核苷酸类似物具有广泛的耐受性。它是测定长段DNA序列的首选酶。测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列。实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。为了充分利用测序酶极高的持续合成能力，可采用两步测序反应。第一步首先采用低浓度的dNTP的较低温度， 以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP和较低温度，以便将合成反应限制在适度之下并确保放射性标记dNTP的有效掺入，这步反应的产物是仅仅延伸了20-30碱基的引物。 再将第一步反应等分于4组1套的标准反应系统中，每组反应中都含有高浓度的d NTP和一种ddNTP。这样聚合反应就得以继续，直至造成链终止的核革酸掺入正在增长的链中。
（4）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶适用于测定在37 ℃形成大段稳定十级结构的单链DNA模板序列。这是因为Taq DNA聚合酶在70-75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。按照1nnis 等（1988）介绍的方法使用Taq DNA聚合酶进行测序，在放射自显影片上得到的测序梯连续数百个碱基条带始终清晰如一，表明这种酶的持续合成能力甚佳。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。模板链的每一个A、每一个G或每一个T的位置上。
４．放射性标记的dNTP
　　直至几年以前，实际上所有DNA测序反应都用[α－32P]dNTP来进行。然而32P发射的强β粒子造成两个问题。首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列（尤其是从放射自显影片的上部所读取的序列）的正确性并将制约从单一凝胶上能读出的核苷酸序列的长度。其次32P的衰变会引起样品中DNA的辐射分解，因此用32P进行标记的测序反应只能保存一两天，否则DNA将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假莫辨。[35S]dATP的引入（Biggin等，1983）大大缓解了上述两方面的矛盾。由于35S衰变产生较弱的β粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反应中确切测定数百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反应可在－20℃保存至1周，而分辨率不见下降。这样，职果聚丙烯酰胺凝胶方面了发生技术故障，只要对测序反应进行重分析即可。
５．dNTP类似物
　　二重对称的DNA区段（特别是GC含量高者）可以形成链内二级过程中不能充分变性。因此将引起不规则迁移，使邻近的DNA条带压缩在一起，以致难以读出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构的存在，而且不可能通过改变测序反应中出序列。这种压缩现象归因于DNA二级结构地存在，而且不可能通过改变测序反应中所用DNA聚合酶的种类而得到减轻。但是凝胶中的压缩区段往往可以通过采用诸如dITP（2'－脱氧次黄苷15' －三磷酸）或7－脱氮－dGTP（7－脱氮－2'－脱氧鸟苷－5' －三磷酸）等核苷酸类似物进行分辨。这些类似物与普通碱基的配对能力较弱，而且是测序酶和Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶的合适底物（Gough和Murray，1983;Mixusawa等，1986;Innis等，1988）。但对某些压缩条带，7－脱氮－dGTP无济于事；同样，dITP也无补于另一压缩条带（尤其是得于GC丰富区的缩条带）的分辨。如果需要采用类似物，首先可试用dOTP，如果压缩条带用d ITP或7－脱氮－dGTP都无法分辨， 则转而测定另一条链的DNA序列几乎总能如愿以偿。如上所述，两种形式的测序酶和Taq DNA聚合酶对核苷酸类似物的耐受性优于大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段。此外，制造厂商声称在测定含稳固二结构的模板序列时，测序酶2.0版要优于原来的测序酶。测序酶2.0版持续合成能力强于测序酶，其作用总是一气呵成，很少半途而废，因而消除了“鬼”带。 而且，测序酶2.0版对诸如dITP类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。 

　　与包括合成反应的链终止技术不同，Maxam-Gilbert法要对原DNA进行化学降解。这一方法是在体外研究lac阻抑制与lac操纵基因相互作用时酝酿发展起来的。时至今日，可以探测DNA构象的蛋白质－DNA相到作用，仍然是Maxam- Gilbert法独具的鲜明特点。在这一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一个末端标记的DNA片段在5组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某于种或某一类碱基。因此生成5组放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。相对而言，Maxam-Gilbert法自初次提出以来，基本没有变化。虽然设计了另一些化学降解反应（见综述：Ambrose和Pless，1987），但这些反应一般只作为Maxam和Gilbert(1977，1980)最早提出的反应的补充。这一方法的成败，完全取决于上述这些佞两步进行的降解反应的特异性。第一步先对特定碱基（或特定类型的碱基）进行化学修饰，而第二步修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5'和3'的磷酸二酯链断裂。在每种情况下，这些反应都要在精心控制的条件下进行，以确保每一个DNA分子平均只有一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5'和3'位置，得到一组长度从一到数百个核苷酸不等的末端标记分子。比较G、A＋G、C＋T、C和A>C各个泳道， 右从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列。由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能测定的长充要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。在70年代Maxam-Gilbert法和Sanger法刚刚问世时，利用化学降解进行测序不但重现性更高，而且也容易为普通研究人员所掌握。Sanger 法南非要单链模板和特异寡核苷酸的，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow 片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需要人所共的简单化学试剂。但随着M13 噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。然而，由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。 类核苷酸类惟物的耐受性看来也优于原来的测序酶。

　　一、概述
　　Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物， 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
　　Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
　　退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
　　由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
　　二、材料 待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。
　　三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。
　　四、试剂
　　（1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
　　（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。
　　（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。
　　（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA •2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。
　　（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。
　　（6）TEMED
　　（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。
　　（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。
　　（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。
　　（10）95%乙醇。
　　（11）0.5%冰乙酸。
　　（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
　　五、操作步骤：
　　成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点： 　　
　　（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。 　　
　　（2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。 　　
　　（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。

　　（一）测序反应： 　　　
　　1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 　　
　　2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂： 　　
　　（1） 样品反应： 　　
　　　　质粒模板DNA 2.1pmol 　　
　　　　5×测序缓冲液 5ml 　　
　　　　引物 4.5pmol 　　
　　　　无菌ddH2O 至终体积16ml 　　

　　（2）对照反应
　　　　pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)　　 4.0ml 　　
　　　　5×测序缓冲液 5ml 　　
　　　　pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 　　
　　　　无菌ddH2 O 至终体积 16 ml
　　3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
　　4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
　　5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
　　6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
　　7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。
　　[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板种类/长度 模板量
200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)

　　由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。 　　
　　2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式： 　　
　　4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数 　　
　　计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式： 　　
　　dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数 　　
　　ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数
　　3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。 　　
　　模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%
　　95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。 　　
　　模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
　　95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。

　　（二）、 测序凝胶板的制备
　　1、玻璃板的处理：
　　银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
　　（1）短玻璃板的处理
　　A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。
　　B. 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。
　　C. 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。
　　[注意] 1. 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。
　　　　　　2. 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。
　　　　　　3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。
　　(2)、长玻璃板的处理
　　A. 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
　　B. 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。 　　
　　[注意] 1. 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。
　　2、凝胶的制备：
　　（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。
　　（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至99.2ml，并用0.45mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
  凝胶终浓度
  3 4 5 6 8 12 16 18
尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0
Acr&Bis(ml) 7.5  10.0  12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0
10×TBE缓冲液(ml)  10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0
双蒸水(ml)  47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0
10%过硫酸铵(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7
TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40
　　(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。
　　[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
　　　　　　2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。
　　（三）电泳：
　　1、预电泳
　　（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。
　　（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。
　　（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。
　　（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。
　　（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。
　　[注意]
　　（1）. 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。
　　（2）. 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。
　　2、样品的制备：
　　当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.4mm。厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
　　3、上样及电泳
　　关闭电泳仪，用移液枪吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长，0.2mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。
　　[注意]
　　1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。
　　2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。

　　（四）、 测序凝胶的银染
　　染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 　　
　　1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。 　　
　　2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。 　　
　　3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。 　　
　　4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。 　　
　　5. 凝胶显影：
　　　(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
　　　(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
　　　(3). 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。 　　
　　6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。 　　
　　7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
　　8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
　　[注意]　测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。 　　
　　1. 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。 　　
　　2. 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。
　　3. 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。 　　
　　4. 如果凝胶厚度超过0.4mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。 　　
　　5. 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

　　（五）、EDF胶片显影 　
　　使用EDF胶片可增强测序条带的对比度，如果测序胶上条带很淡，我们建议把数据转移至EDF胶片，银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。 　　
　　1. 在暗室内，将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板，亦可用白灯箱，为确保曝光时间, 用一小条EDF胶片曝光不同时间, 检查不同的曝光强度, 一般曝光20--40秒可得较好结果。
　　2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角, 然后把胶片置于凝胶上，使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的，因此必须确保缺口在左上角。
　　3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板，开亮灯箱约20秒。
　　4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片，可使用下列操作过程: 　　
　　　a. 在Kodak GBX显影液中显影1-5分钟; 　　
　　　b. 水洗1分钟; 　　
　　　c. 在Kodak GBX定影液中定影3分钟; 　　
　　　d. 水洗1分钟.
　　[注意] 1. 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作, 以免印上指纹。同时注意　　　　　EDF胶片不能用自动胶片处理器。
　　2. 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同，通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用　　　光源的最佳曝光时间，参阅胶片说明书。
　　3. 曝光时间短则EDF胶片影像较深，曝光时间长则有助于减弱背景。

一、概述
　　T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后，可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。
使用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩, 对于许多模板来说, 使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而, 如果出现了带压缩的问题，则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入，使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。
　　T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应(Chase step)。 然而对于有紧密二级结构的区域, 错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况，应使用一些高温DNA聚合酶，如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。
　　T7 DNA聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反转录酶AMV而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。
　　T7 DNA聚合酶测序时DNA的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的DNA片段。
　　二、材料 待测的DNA模板，可用双链或单链模板。
　　三、设备 高压电泳仪，测序用电泳槽，照相显影用大号塑料盆，制胶设备，吹风机，放射自显影盒，X-光片。
　　四、试剂
　　1、5×T7 DNA聚合酶缓冲液：200mmol/L Tris•Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。
　　2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。
　　3、DTT ： 0.1mol/L。
　　4、5×常规标记混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
　　5、5×dITP标记混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。
　　6、dNTP A溶液（适用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCL。
　　7、ddG终止混合物 (适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddGTP。
　　8、ddA终止混合物 (适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddATP。
　　9、ddT终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddTTP。
　　10、ddC 终止混合物(适用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddCTP。
　　11、dNTP B溶液（适用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCl。
　　12、ddG终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。
　　13、ddA 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。
　　14、ddT 终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。
　　15、dd C终止混合物(适用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。
　　16、测序用T7 DNA测序酶。
　　17、酶稀释缓冲液：10mmol/L Tris•HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。
　　18、终止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯兰 。
　　19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S的优点是可使条带为窄而清晰，并且操作更为安全。放射强度为：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。
　　20、TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。
　　21、上节所述的凝胶制备过程中的全套试剂。
　　22、X光显影液：H2O：50℃ 800ml，米吐尔 2.2g，无水Na2SO3 72g，对苯二酚 8.8g，无水NaCO3 48g , KBr 4g， 定容至1000ml备用。
　　23、F-5坚膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉状钾矾 15g ，定容至1000ml 备用。
　　24、TYP肉汁培养基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。
　　25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）储备液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac储备液等体积混合。
　　五、操作步骤：
　　（一）、模板制备
　　1、M13单链模板制备：在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG的培养基上铺板之后, 含有M13重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑"，事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死，出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故, 从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。
　　　（1）过夜培养的宿主细胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培养基以1:100稀释。在37℃强烈震荡1小时之后, 细胞进入对数早期。此时, 将一个合适的含有重组M13的噬菌斑(连同琼脂)用滴管转入该细胞培养液中。
　　　（2）37℃强烈震荡(300rpm) 培养6小时。
　　　（3）把细胞培养液转入两只1.5ml eppendorf管, 12000g离心15分钟。上清液转移到新的eppendorf管再离心15分钟。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀), 再转到新的eppendorf管。 .
　　　（4）将0.25体积的含20％PEG(-8000)的3.75M醋酸铵(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌体。混匀后置冰上30分钟, 再以12000g离心15分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用吸液器尖头将残留的PEG充分吸干净。此时应能见管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。
　　　（5）将沉淀物重溶于400ml TE缓冲液中。
　　　（6）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈震荡1分钟，12000g离心5分钟。
　　　（7）将水相转入一新的eppendorf管, 注意不能触动原管中两相交界面。加等体积苯酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1分钟, 12000g离心5分钟。
　　　（8）将上层水相转入另一新的eppendorf管, 重复第7步的提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质存在。
　　　（9）将上层水相转入一新的eppendorf管, 加等体积氯仿, 强烈振荡1分钟后, 12000g离心5分钟, 多次重复此步骤。
　　　（10）将上层水相转入新的eppendorf管, 加0.5倍体积的7.5 mol/L 醋酸铵, 2倍体积乙醇, 混匀后-20℃放置 30分钟。
　　　（11）12000g离心15分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被搅起, 重新离心, 倾去酒精, 真空干燥沉淀物。
　　　（12）将DNA的沉淀物溶解于20ml去离子水中，取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳定量, 如果DNA量充足, 则可进行退火测序。
　　2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备：
噬粒是指含有丝状单链DNA噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA模板。
　　　（1）从新鲜平板上挑得含pGEM质粒DNA的抗Amp单菌落, 并接种到100ml含有50mg/ml氨苄的TYP肉汤培养基中, 在37℃振荡过夜。
　　　（2）取100ml过夜培养物接种到另一新的装有5ml 含50mg/mlAmp的TYP肉汁培养基的试管中, 在37℃强烈振荡30分钟。
　　　（3）加40μl辅助噬菌体R408或M13 K07, 继续剧烈搅拌振荡培养6-8小时，使辅助噬菌体超感染。
　　　（4）12000g离心15分钟后，去除沉淀，取上清，转移到一新eppendorf管中再次离心15分钟, 小心地取1-1.2ml上清液(注意不能触及沉淀)。
　　　（5）将0.25体积的含20％ PEG-的3.75M醋酸铵加入上清液以沉淀噬菌体颗粒。混匀后置冰上30分钟, 再以12000g离心15分钟, 倾去上清液, 再以同样方法离心一次, 用移液器尖头将残留的PEG溶液吸净。此时应能看到管底有芝麻大小的噬菌体颗粒沉淀。
　　　（6）将沉淀物溶解于400ml TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。
　　　（7）加等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液, 强烈振荡1分钟, 再以12000g离心5分钟。
　　　（8）将水相转入一干净eppendorf管(不要触动原管中两相交界面), 加等体积酚/氯仿(1:1)混合液, 强烈振荡1分钟, 12000g离心5分钟。
　　　（9）上层水相转入一干净eppendorf管重复第8步骤提取, 如有必要重复多次直至二相之间无可见物质。
　　　（10）将上层水相转入一干净eppendorf管加等体积氯仿, 强烈振荡1分钟后离心, 多次重复此步骤。
　　　（11）将上层水相转入一干净eppendorf管加0.5倍体积7.5mol/L pH7.5醋酸铵, 再加2倍体积乙醇, 混和后-20℃放置30分钟。
　　　（12）12000g离心15分钟, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被搅起,重新离心, 倾去乙醇, 真空干燥沉淀。
　　　（13）将沉淀物溶解于20ml去离子水中, 取2ml样品进行琼脂糖凝胶电泳进行定量，如果DNA量充足，则进行退火和测序。
　　3、质粒膜板制备：参照第一章所述的方法。
　　（二）超螺旋质粒DNA的碱变性：
　　1、取4mg（约2pmol）超螺旋质粒DNA至一eppendorf管中，加无离子水到终体积18ml。
　　2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室温(25℃下）保温5分钟。
　　3、加2ml 2mol/L NaAc溶液(pH4.6)涡旋混匀，使之中和。
　　4、加75ml无水乙醇，充分混匀后，置于干冰或-70℃沉淀10分钟。
　　5、于12000g离心10分钟，弃去上清，用200ml预冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml无离子水中。
　　（三）、测序反应：
　　1、引物和模板的退火：
　　（1）在一离心管中，混合如下几种试剂：
　　　　引物 约1-2pmol
　　　　5×T7 DNA聚合酶测序反应缓冲液 2ml
　　　　DNA 约1mg
　　　　加ddH2O终体积至10ml 。
　　（2）将试管盖盖上后，65℃ 加热2分钟，然后在大约30分钟左右的时间内，使试管的温度缓慢地降到室温。降温的过程中可使用小的加热板或小型的保温仪，也可使用已调至65℃的水浴，使它们的温度在室温下缓慢地降至室温即可。当温度降至30℃以下时，退火结束。可将小试管置于冰上，退火完毕的模板须在4小时内使用。
　　2、标记反应
　　（1）在一个标准的反应过程中（从引物处开始，可读到500个碱基以上），首先需要按1:5稀释标记混合物。如4ml 混合物则加双蒸无离子水16ml。该稀释液储存在 -20℃可使用数周。如果所要测定的序列小于30个碱基，可将标记缓冲液稀释15倍，同时，模板DNA要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，会降低标记反应的程度，即只标记引物后的几个核苷酸。
　　（2）用冰预冷的TE缓冲液按1:8稀释T7 DNA聚合酶。酶液稀释后应立即使用，置于冰浴不宜超过60分钟。不得使用标记混合物、DTT溶液或非缓冲液类溶液稀释酶液。
　　（3）在已退火的引物 -模板混合物中，依次加入：
　　　　0.1mol/L DTT 1.0ml
　　　　标记混合物 2.0ml
　　　　[a-35P]dATP或[a-35S]dATP 0.5ml
　　　　已稀释好的T7 DNA聚合酶 2.0ml
　　混合充分（注意不得产生气泡），置于室温5-10分钟。
　　如果在电泳时碰到带压缩问题，则dITP 混合物的效果优于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法与dGTP混合物的使用是相似的。
　　[注意] 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。
　　　　　　2、在第（3）步的过程中，如果反应中有几次冷却，保温的时间过长或温度太高的话，则会使测序反应短于100个碱基。
　　　　　　3、链终止反应：
　　　　　　（1）取4支eppendorf管分别标上G，A，T，C。
　　　　　　（2）每个管分别加入2.5ml G，A，T，C链末端终止混合物，立即盖上盖子以防液体蒸发（本反应最好在标记反应前做好）。dGTP和dITP混合物依据各自需要 选用。
　　　　　　（3）将eppendorf管预热至37℃ 1分钟。
　　　　　　（4）待标记反应完毕后，取3.5ml标记反应液至上述4支eppendorf管中，稍微离心一下，并将上述四管置于37℃保温。注意在每一次反应中，均应使用新的吸液头，以免交叉污染。
　　　　　　（5）继续保温3-5分钟（若使用dITP时，保温时间可延长至30分钟，对反应产物没有任何影响。
　　　　　　（6）在上述四管中各加入4ml终止缓冲液。混合均匀后，置于冰浴中。本样品即可上样电泳。用35S标记反应的样品可置于-20℃保存一周，此时样品只有极少量的降解。而32P标记的则需在当天电泳以免降解。
　　（四）测序凝胶板的制备及电泳 参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75-80℃ 2分钟，立即上样，每个泳道的使用量为2-3ml
　　（五）测序凝胶板的干燥及放射自显影。
　　电泳完毕后，经32P或35S标记的产物可用对b-射线敏感的X-光胶片放射自显影检测。
　　1、取下电泳的玻璃板，去除两边的压条，用小的薄钢片撬开玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷处理过，凝胶会紧紧地粘合于玻璃板上，则凝胶与玻璃板一起进行下面步骤的处理。如果玻璃板没有经过粘合硅烷的处理，则可用3MM大滤纸贴在有凝胶的玻璃板上，小心地揭下凝胶，准备下一步的处理。
　　2、去除尿素，将含有凝胶的玻璃板或滤纸浸于含有2升10%冰醋酸的大号显液盆中，轻轻振荡15分钟，去除尿素。
　　3、干胶：含有凝胶的玻璃板可用电吹风吹干，而含有凝胶的滤纸则可用专用的干胶设备如真空加热干胶仪抽干。
　　4、已经干燥的凝胶即可进行放射自显影。在玻璃板含有凝胶的这一面加上X-光片后，用另一块相似大小的玻璃板夹住，然后用夹子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝胶的滤纸则可置于X-光曝光盒中放射自显影。一般32P曝光过夜即可，而35S为2-3天。
　　5、曝光完毕后的X-光片即可冲洗，获得序列信息。将X光片置于水中先湿润，然后置于显影液中显影，直至条带清晰显示为止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分钟以上。取出X-光片干燥并读出序列。
　　[ 注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有残存的尿素，则在干胶过程中会使凝胶很粘，而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分钟，第二次10分钟。如果胶浓度高于12%，则有可能在干胶过程中会产生皱纹，防止的方法有二种：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥胶，直接在冰箱中以冰冻状态曝光，应注意的是在使用这个方法时，要在凝胶和X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。
　　2、凝胶一定要充分干燥方可进行曝光，否则X-光片会粘在胶的表面，致使以后的操作困难。
　　3、曝光时间应根据所使用的同位素而定，如果同位素已过半衰期则应相应延长曝光的时间。

鸟枪法测序的操作方法
1. 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA, 并用Agarose凝胶电泳进行回收。
2. 对回收的大片段DNA用物理方法 (如超声波等) 进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段 DNA进行末端平滑化。
3. 进行Agarose电泳，切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的 3'端加上一个A碱基。
4. 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
5. 对阳性克隆（含1 kbp ~ 2 kbp Insert）进行DNA测序。
6. 对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

DNA测序量
应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率)，对每个反应的有效测序长度定义为600 Bases。
如：对100 kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：
6倍测序量＝100,000 Bases×6/600 Bases＝1000个反应
8倍测序量＝100,000 Bases×8/600 Bases＝1333个反应

结果编辑
按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段 (Contig)。
补缺工作
结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段 (Contig) 间的序列没有测定，此时应该通过primer walking来测序，进行整体DNA序列的补缺工作。

　  测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。
一、 试剂准备
１． 硅化液：四氯化碳 250ml，二氯二甲基硅烷 25ml。
２． 6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺 28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE 50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED 50μl，轻摇混匀，立即灌胶。
3.质粒DNA碱变性液：NaOH 2M，NaAc 3M（pH4.8），无水乙醇，70%乙醇。
4.T7测序试剂盒。
二、操作步骤
1.  测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。
2.  灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。夹好，将测序板放水平。聚合约3hr后预电泳。
3.  预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。设置温度50℃，功率100W，时间约30min。
（同时准备测序反应）
4.  质粒DNA双链碱变性：DNA 3-5μg溶于32μl ddH2O中，加2N NaOH 8μl，混匀，室温静置15min。加3M NaAc 7μl，无水乙醇120μl，混匀，-20℃放置30min。离心12000g× 15min，弃上清，70%乙醇500μl洗一次，离心12000g×7min。弃上清，晾干沉淀，10μl灭菌ddH2O溶解。
5.  模板与引物复性：加2μl测序引物、2μl Annealing buffer， 混匀，稍稍离心，65℃温育 5min，立即放置于37℃10min，室温5min以上。
6.  标记反应：加 3μl labeling mixture 、1μl相应放射性同位素（10μCi）、2μl T7测序酶（使用前以稀释液1∶5稀释），混匀，离心，置37℃5min。
7.  预先准备四个0.5ml微量离心管，标上A、C、G、T，分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。
8.  链终止反应：在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl，37℃ 5min。加入stop solution 5μl，短暂离心。
9.  上样：关上预电泳电源，冲洗胶平面，将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。将四个反应管置80℃ 2min。立即取1.5-2μl加到加样孔上。
10．电泳: 50℃，100W，电泳2.5hr后，暂停电泳，在预留孔二次上样后，继续电泳2.5hr。
11．下胶：停止电泳，取下测序板，倒掉电泳缓冲液。拆开测序板，凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。裁一张比胶稍大一些的滤纸，平铺在胶上，掀起滤纸，凝胶就被一起掀起。
12．压片：将凝胶盖上保鲜膜，用monitor测读放射强度，以估计曝光时    间。在暗室中覆上X光片，置暗夹中，-70℃放射自显影。
13．洗片、读片：取出暗夹，回到室温。经D72显影、酸性定影液定影，水洗, 晾干。在X光片灯上读出序列。
三、注意事项
1.    测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生，下胶时则易使电泳胶损坏。
2. 灌胶时要避免胶的渗漏；注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时，注意速度的控制，防止气泡的产生。
3. 测序反应及电泳上样时要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。
4. 规范、妥善处理放射性同位素接触物品及废弃物。
  手工测序需要使用同位素，这给操作带来许多不便，对操作者也有一定的损害。DNA测序仪的出现解决了这一问题，它不使用同位素标记，自动化程度高，测序效果好。虽然DNA测序仪的价格目前仍比较高，但每次测序的花费并不算高，而且商品化服务也令人满意。

确证性测序（例如对利用寡核苷酸倡导的诱变而产生的突变体进行测序）往往只需要仅仅一套反应，以取得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序，即可如原以偿。在许多情况下，等测区落于通用引物的测序范围之内；若不然，最好的方法就是合成一段长度为17-19核苷酸的寡核苷酸引物，与距离待测区约50-100核苷酸的序列互补。只要可能，应同时测定野生型基因上同源区的序列和突变的相应序列。直接在同一张放射自显影片上对照有关序列，极有助于确证变异区序列并将使突变体与野生型基因之间任何出乎意料之外的其他差异一目了然。

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　　从头测序的目的是要提供一段DNA的准确核苷酸序列，这一区段可长达数千碱基，而其序列从来未经测定。由于单套测序反应所能准确测定的靶DNA序列最长可达400碱基左右，因引进行从头侧序必须经过精心策划。长约400碱基的枝DNA可以按互为相反的方向分别克隆于2种M13噬菌体载体（如M13mp18 和13mp 119）上。然后每条链的全序列可以通过利用通用测序引物进行的单套反应得以测定。如果要对更长的靶DNA（如长达数千碱基）进行测序，则可在两种通用策略中一而行：
（1）随机法（或鸟枪测序法） 在随机法中，序列资料是从含有靶DNA随机片段的亚克隆中收集而来的。既不须努力确定这些亚克隆在靶DNA中的位置，也不必设法查明究竟测出的是哪一条链的序列，只要把积累资料贮存起来，最后可用计算机排列妥当（Staden，1986）。这一方法是由剑桥的医学研究委员会（M．R．C．）实验室率推行的，曾经成功地用于测定人线粒体DNA（Anderson 等，1981）、人腺病毒DNA（Gingeras等，1982;Roberts等，1986）、λ噬菌体DNA（Sanger等，1982），以及Epstenin-Barr病毒DNA（Baer等， 1984）的序列。
（2）定向法 在定向法中，靶DNA的测序按计划有秩序地进行。例如，靶DNA的全序列可以通过测定一系列嵌套的缺失突变体的序列而获得，这些突变体具有相同的起点（通常在靶DNA的一端）并分别穿入靶序列区纵深不同距离处，因此它们可以使靶DNA中更遥不可及的区段渐进地落入可利用通用引物进行测序的范围之中。另一种方法是，利用一套反应中取得的核苷酸序列设计新的寡核苷酸充当后续一套反应的引物，从而循序渐进地获得从示测定过的靶DNA片段的序列。因此在这一方法中。DNA序列的积累是通过沿DNA链渐进移动引物结合位点而实现的。尽管对随机法与定向法的取舍通常由实验室的物力与专长所决定，但仍有一少其他因素也会影响最终的抉择，这些将在稍后加以讨论。
选择随机定向测定策略的影响因素
（1）计算设备 任何大规模的测序计划将在很大程度上依赖计算机程序对原始序列资料进行分类、整理和排列（Staden，1986）。在权衡随机法的利与弊之时，必须将与适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。如果这些设备尚无从适当的计算机设备进行联机的问题放到压倒一切的位置上来考虑。如果这些设备尚无从谈起，就必须将采用随机策略的想法束之高阁，转而从前已述及的两种定向方法中择一而行。
（2）靶DNA的性质：如果靶DNA很可能会有散在的重复序列，那么就应当组建嵌套的缺失体用于测序。计算机在区分重复序列方面可能束手无策，而寡核苷酸引物则会同多个位点发生退火。
（3）完成测序计划所需时间：完成一个测序计旬所需工作蜈可通过以下指示进行估计：
1）从单套反应中平均可是300-400核苷酸的序列。
2）一个人一天可以轻松自如地操作24-32套反应。
3）因此一个测序工作周，可以测出15kb核苷酸序列，这一周包括：
a.用一天时间制备单链DNA模板。
b.用一天时间测定DNA序列。
c.用一天读出原始DNA序列并加以排列。
d.再用两天生物旱生测序、重新进行电泳，以便澄清模棱两可这处并取得各个克隆之间的重叠区序列。
　　采用随机法，所要测定的序列通常会比靶DNA所具有的实际长度4－6倍。在大多数情况下，直至双链90％左右的序列测出以后，才能得到单一的一段邻接不断的序列。由于进行测序的亚克隆是随机挑选出来的，因此靶DNA某些区段的序列在全段序列未能测出前会被重复测定，至于需要多长时间才能找出最后几个亚克隆并进行测序，从而使序列提以测全，则无法未卜先知。往往会发现，以上亚克隆在文库中得不到充分反映，因此南非要处用与侧翼序列相应的寡核苷酸探针进行筛选，以分离这些亚克隆。利用限制酶将大分子靶DNA进一步分为大小适中（4－5kb）而易于处理的片段，可以使上述推理上难题得以缓和，每一个这样的片段都可以用随机法单独进行测序。
　　定向缺失法有时需要投入大量的时间生成并鉴定一整套嵌套的缺失体。然而一旦这上步水到渠成，则可以从靶DNA上早以妥善安排的多个区段上互为相反的两端向内部延伸，才能测定DNA双逻的全序列。另一种办法是用单套缺失突变体来取得靶DNA单链的序，然后利用其信息合成一套寡核苷酸引物，以便用于确证DNA互补链的序列（见后）。
（4）使用寡核苷酸合成仪的方便程度：如果能够无拘无束地使用寡核苷酸合成仪，则可快速、廉价地合成由用户设计的引物。假定要花1－2天时间来合成一个寡核苷酸，那么在最快速度下每周可以由靶DNA的一个特定起点开始从头测定600-800个核苷酸的序列。如果同时使用几个起点开始从头测序； 或者也可以将M13mp18和M13mp19噬菌体载体，利用通用引物同时从两端开始测序；或者也可以将序列内部的限制酶切片段亚克隆循下列原则：设计DNA测序物时，应遵循下列原则：
1）应寡核苷酸与靶DNA的正确主靶DNA中确凿疑的序列相互补。尤其是利用循序渐进的寡核苷酸法来测定从未测过的DNA序列时，这一点更加重要。尽量让新设计的寡核苷酸互补于已知序列的最远端，这是十分自然的人民代表倾向。然而在大多数情况下，该序列是从测序凝胶顶部间隔紧密的条带中读取的，而在此处发生阅读错误往往司空见惯。因此紧好保守一些，让所设计的引物与位于样品泳前沿之后一定距离内的序列机互补，在凝胶的这一区段上读出的序列可信程度较高。
2）引物的碱基组分比便应匀称[40-55％（G＋C）]， 而且长度至少应有18个核苷酸。 如果（G＋C）％
在上述阈值之外，应将寡核苷酸长度设计为（18+n/2）个核苷酸，其中对AT丰富区，则n=50-（G＋C）％对GC丰富区，则n=（G＋C）％－50。
3）检查新设计二重对称区，因为可自杂交形在发夹或茎环结构的寡核苷酸是低物。效引
a.其中不含二重对称区，因为可自杂交形成发夹或茎环结构地寡核苷酸是低效引物。
b.它既不会同载体DNA也不会同序列已经测出的靶DNA区段相互补，如能保证这一点，将大大减少寡核苷酸从模板DNA的不只一个位置上引导DNA合成的可能性。已商品化的大部分用于DNA分析的计算机程序都能够从序列中检索合成寡核苷酸的互补区。
（5）序列的准确性：如果认真地进行DNA序列测定，错误率将小于0.1 ％。但要达到这样高的准确性，必须完整地测定靶DNA两条链的序列并澄清棱两可及相互矛盾之处。在这一点上随机测序有其优点，因为在该方法中耐需要骤步对丰余的原始序列资料进行累积，从而使最终所排出的序列的准确性大为改观。然而靶DNA中可能存在一些区域，无论采用随机法还是定向法都不能准确测定其序列。解决这些凝难序列往往需要花费意外长的时间，有时还要使用碱基类似物（以消除条带压缩现象）或Maxam-Gilbert测序法。
（6）测序计划的下一步打算：不同的测序策略将会得到不同类型的样品材料，这些材料可用于以后的实验。例如，为NDA测序而构建的多套缺失体可用于研究启动子区中的结构域，而与靶片段不同区段互补的多套寡核苷酸，可用于测定靶DNA突变体的序列。为鸟枪法测序而构建可以留作随后进行定点诱变或制备放射性标记探针的材料

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DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?
    答：溶解DNA测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq酶的聚合反应,需要一个最佳的 酶反应条件.如果DNA用缓冲液溶解后,在进行了测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体 系条件,造成Taq酶的聚合性能下降。 有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性， 但TE Buffer对DNA测序反应有影响，根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。

提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供为好？
    答：一般菌体的形态有：平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌或新鲜菌液等。我们提倡寄送穿刺培养菌或新鲜菌液。 平板培养菌运送特别不方便，我们收到的一些平板培养菌的培养皿在运送过程中常常已经破碎，面目全非，需要用户重新寄样。这样既误时间，又浪费客户的样品。一 旦是客户非常重要的样品时，其后果更不可设想。而甘油保存菌则容易污染。 制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37℃ 培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在4℃下可保存数个月，并且不容易污染，便于运送。

    答：对于通用测序引物，只要正确使用，一般不会有太大问题，测序引物问题主要发生在客户自己提供的PCR引物上。应该明确的一点是并不是所用的用于PCR的引物都可以用来作测序，以下几种PCR引物将是不适 合用作测序引物的：
（1）简并引物， 简并引物必然要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果。
（2）随机引物，如RAPD引物， 随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好地与模板结合。
（3）过长的引物，一般要求测序引物不大于24bp，最长不能超过30bp。 过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯度要在90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将 明显增大，直接影响到测序结果。
（4）有特殊标记的引物，
该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样，荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标记基团将直接影响到DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误。
（5）不纯的引物，
测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。以一个20bp的测序引物为例， 直接脱盐纯化的话，纯度至多在70%左右，也就是说将有30%的引物将作为背景噪音，这必将严重影响测序结果。 一般经PAGE或OPC法纯化的引物基本能达到测序的要求。 

怎样选择（设计）测序用引物？
   答：测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3’端的几个碱基能完 全配对，即使引物长达80～100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。 而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Primer设计。在 本公司测序时，我们可免费帮助设计测序用引物。
（1）长度在15～25个碱基左右，一般选择20个碱基（根据GC含量作适当调整），
（2）3’端尽量选择G或C碱基（但不绝对），以增加与模板的结合能力。
（3）Tm温度应选择50℃～70℃左右。
（4）GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。
（5）避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。
（6）保证引物和模板100%匹配，特别是3’端的几个碱基一定要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间 只能有一个结合位点。 

PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别？
   答:众所周知，PCR圹增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接 测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数 分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就是反映不出来了。因此， PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。

我的基因序列与标准序列为什么有差别？
   答：一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在PCR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。 ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较 长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度 减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向 测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。

过短的PCR产物为什么不适于直接测序？
   答：首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的 PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的 干扰更大，很容易造成测序失败。

用测序的方法检测点突变可靠吗？
   答：用测序的方法检测点突变体，可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。

 DNA序列分析的内容
1确定开放读码框
通过翻译得到6条读码框后，下一步就要确定哪个是正确的阅读框。通常，我们选择中间没有被终止密码子（TGA、TAA、或TAG）隔开的最大读码框作为正确结果，即开放读码框（Open Readin Frame，简称ORF）。ORF的结尾比它的起始容易判断。一般编码序列的起始位点是蛋氨酸的密码子ATG；但蛋氨酸在编码序列内部也经常出现，即ATG并不一定是ORF的起始标志。因此，有必要应用其它方法找到5'端非编码区的末端。
幸运的是，确实有一些规律可以帮助我们在DNA中找到蛋白质编码区。就像上面提到的足够长度的ORF（基于随机出现较长ORF的概率很小的事实）。识别边缘处的Kozak序列对确定编码区的起始位点也有一定帮助。而且，密码子在编码区和非编码区有不同的统计规律。尤其是一些特殊氨基酸在不同物种中密码子的使用情况有很大区别，偏爱密码子的规律在非编码区体现不出来。因此，偏爱密码子的统计分析有助于推测5'及3'非编码区，并对发现错误翻译也有所帮助，因为在错误翻译中不常用的密码子会大量出现。不同物种对某些氨基酸使用不同密码子的情况，可见区别非常大。据目前所知，共有六种三联体密码子编码丝氨酸。每种丝氨酸密码子都有可能在CDS中出现，不同物种对密码子的使用具有高度选择性。这种特性可以用于帮助预测DNA的那些区域可能编码蛋白质。
 
除了特定的偏爱密码子，许多物种密码子的第3个碱基位置倾向使用G或C而不是A或T。因此，G/C在这个位置的出现频率较高，这一特征可以进一步用来确定ORF。
最后，如果在起始密码子上游发现核糖体结合位点，就可以更肯定的说找到了一个ORF，因为核糖体结合位点指导核糖体结合到正确的翻译起始部位。但是，不管怎样，预测基因最可靠的方法恐怕还得与同源蛋白质序列比较。

2 内含子与外显子
真核生物的基因有外显子与内含子两部分，外显子组成编码区，内含子不参与编码区的组成。真核生物基因有外显子/内含子的一个结果就是其基因产物可能有不同的长度，因为并非所有的外显子都包含在最终的mRNA中（包含在mRNA内的外显子的排列顺序没有改变）。由于mRNA的编辑产生了不同的多肽，进而形成不同蛋白质，这些蛋白质就互称为剪切变体（Splice Variants）或者可变剪切形式（Alternatively Spliced Forms）。因此，查询cDNA或mRNA数据库（转录水平的信息）时，匹配结果看上去有缺失的部分，而实际上，这可能是可变剪切的结果。
 
3 DNA序列拼接
DNA序列分析的另一个重要方面是将一个DNA克隆经自动测序得到的片段装配成完整的核苷酸序列。有些生化分析要求有相当准确的序列数据，对于一个序列已知的基因，必须核实克隆得到的序列是否与已知基因的序列一致。如果不一致，就必须设计实验加以修正。克隆出错的原因可能是多方面的，如使用了不恰当的引物，或在多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）中使用了低效率的酶。
克隆可以是能够直接测序的mRNA，或是以mRNA为模板合成的cDNA。单链克隆的测序过程如下：先根据克隆载体上插入位点两端的寡核苷酸序列设计引物，引物与相应序列杂交上后，它们就以插入序列为模板开始延伸。
双脱氧核苷酸（ddATP，ddTTP，ddGTP，ddCTP）可以终止延伸反应。由于反应体系中有大量的脱氧核苷酸（dATP，dTTP，dGTP，dCTP），它们与双脱氧核苷酸随机结合到模板上，因此延伸反应会终止在不同的碱基上，结果每个引物都合成了一系列不同长度的片段。这些片段通过放射性同位素电泳或者荧光法测序。一般情况下，一次试验不可能测定CDS的全长，因此必须通过重叠片段的多重比对得到整个CDS，这就必须进行序列拼接。
序列拼接软件通过计算序列中每个位点上各种核苷酸可能出现的分值，找出一致序列（Consensus Sequence）。可以设置一些参数来约束每个位点允许出现的错配数。通常，为确定序列拼接的质量，需要对一个片段进行多次测序。正链和负链上每个位置至少在两次以上测序结果一致，该位点的测序结果的才比较可信；相反，序列中的某一位点几次测序结果不一致，这一位点的可信度则较低。
 
测序并得到高可信度的序列是一项需要时间和耐心的工作，尤其在使用自动荧光测序仪进行高通量测序时，更是如此。一个高质量的序列，需要一个熟练的分析人员，在一套可靠的分析软件的帮助下经过数小时对荧光图谱（测序原始资料）的分析才能获得。分析人员要熟悉测序实验操作的缺欠，了解GC富集区（导致强的DNA二级结构域并影响测序结果），重复序列等的影响，所有这些使序列拼接成为一项高技术工作。

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1 核酸序列的检索
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide

2 核酸序列的同源性分析
2.1 基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi
2.2 核酸序列的两两比较
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html
2.3 核酸序列的批量联网同源性分析(方案)

3 核酸序列的电子延伸
3.1 利用UniGene数据库进行电子延伸(方案)
3.2 利用Tigem的EST Machine进行电子延伸
EST Extractor: http://gcg.tigem.it/blastextract/estextract.html
EST Assembly: http://www.tigem/ESTmachine.html
1.3.3 利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸
http://gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html

4 核酸序列的开放阅读框架分析
1.4.1基于NCBI/ORF finder的ORF分析
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

5 基因的电子表达谱分析
1.5.1 利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方案）
1.5.2利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析
http://gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html

6 核酸序列的电子基因定位分析
6.1 利用STS数据库进行电子基因定位
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/epcr.cgi
6.2 利用UniGene数据库进行电子基因定位（方案）

7 cDNA的基因组序列分析
7.1 通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析(方案)
7.2 通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geno ... tml&&ORG=Hs
7.3 通过从Sanger Centre查询基因组数据库进行基因组序列的分析
http://www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.shtml

8 基因组序列的初步分析
8.1 基因组序列的内含子/外显子分析
http://www.bioscience.org/urllists/genefind.htm
8.2 基因组序列的启动子分析
http://www-hgc.lbl.gov/projects/promoter.html

9核酸序列的注册
9.1 EST序列的注册(方案)
9.2 较长或全长cDNA序列的注册(方案)
10待分析序列所对应的已知克隆的获取
http://image.llnl.gov/