一、提取外周血淋巴细胞时注意事项

如果取外周血淋巴细胞 (PBMC) 进行ELISPOT检测，最好采用新鲜血液。在保证无菌操作的前提下，首先应保证取血时抗凝剂应及时充分的与血液混匀，避免血凝块的出现。抗凝血最好及时提取PBMC，避免放置时间过长，室温下避免过夜。应选用分离效果好的淋巴细胞分离液，避免PBMC中混有过多其他细胞成分或杂质。

外周血出现溶血后，在使用淋巴细胞分离液分离PBMC时，溶血产生的细胞碎片、血红素等杂质将极大可能悬浮于分离液的层面，在吸取PBMC时非常容易混入这些杂质，由于混入细胞的细胞碎片和血红素很难清洗去除，在进行ELISPOT实验时，有可能沉积在培养板底，严重影响细胞因子和抗体的结合，进而影响实验结果。

使用淋巴细胞分离液，推荐使用进口淋巴细胞分离液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（无寡糖）。避免使用红细胞裂解液分离淋巴细胞。

二、从动物脾脏组织分离淋巴细胞

取动物脾脏组织时，应注意取材的无菌操作。分离出脾脏组织，研磨后过200目筛网，保证所分离的细胞为单个细胞悬液。获得细胞悬液后应该使用相应的淋巴细胞分离液进一步分离单个核细胞。

三、在ELISPOT板上，每孔我应该放置淋巴细胞的数目

在使用ConA，PHA等阳性刺激孔中，一般放置的淋巴细胞数为 10^4～2×10⁵。在使用抗原作为刺激剂的情况下，每孔细胞浓度可在1～4×105。在使用多克隆刺激剂的情况下，应适当调低细胞浓度。但由于所用刺激剂的强度和批号不同，建议初次进行ELISPOT检测时，对刺激剂浓度和细胞浓度设立梯度，以保证较理想的实验结果。

四、对淋巴细胞进行体外刺激预孵育、或板内同步刺激培养

1、将抗原和淋巴细胞在体外混合，刺激并预孵育，是通用的方法。预孵育的淋巴细胞，在置入ELISPOT板之前应使用复温到37℃的培养液清洗细胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培养5～6小时。

2、对于高度特异性抗原，可以采用将淋巴细胞和抗原同时加入ELISPOT板孔中，37℃培养箱中，同步进行刺激、培养、和细胞因子捕获。淋巴细胞板内同步刺激培养的时间通常为22～24小时。

3、ELISPOT试验检测的是每一个分泌细胞因子的活化细胞。在培养细胞过程中，任何移动、震动（包括开关培养箱门）都会导致细胞在培养板上的移动，从而得到不规则斑点或者斑点花纹，影响最终结果。因此细胞在ELISPOT培养板孵育的过程中，应注意保持培养板的静置，不应对其移动。

4、在使用抗原刺激淋巴细胞培养过程中发现培养液变黄，这种现象通常见于使用很强的多克隆抗原刺激淋巴细胞，某些多克隆抗原会导致淋巴细胞凋亡或者死亡，大量淋巴细胞死亡后使培养液变黄。使用这些淋巴细胞进行后续ELISPOT试验通常得到很低的斑点（SPOT）形成。换用特异性抗原后可以避免该现象。

5、在ELISPOT结果中出现不规则的大块斑点，有的区域没有斑点的原因，不规则斑点区域的出现一般是细胞分离不完全所至，有时候采用多克隆抗原孵育的淋巴细胞也会产生成团现象。请确认加入到ELISPOT板中进行孵育的是单细胞悬液。

6、使用开口较大的吸头，动作轻柔，避免对细胞的吹打，减少剪切力对淋巴细胞的伤害。