生命经纬知识库 >>所属分类 >> DNA技术   

核酸提取基因组DNA的提取

标签: 暂无标签

顶[0] 发表评论(41) 编辑词条

DNA 是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA 的提取也应是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作,如不能有效的完成DNA 提取方面的工作,那就根本谈不上进行分子生物学方面的实验。在DNA 提取过程中应做到1,根据不同研究需要,保证结构的相应完整性;2,尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA 等);3,保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。下面结合不同的研究对象列出几种相应的DNA 提取方法。

方法1,基因组总DNA 的大量提取

本方法通过液氮研磨粉碎动植物组织、裂解液裂解细胞、有机溶剂抽提,使进入水相的核酸与蛋白成分分开,在RNA 酶作用下,降解RNA ,得纯度较高的DNA 样品。

一:仪器  高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴、低温冰箱或冰柜、冷冻真空干燥器、取液器、电泳仪、水平电泳槽、紫外观测仪

二:试剂 细胞裂解液(100mM Tris-HCl 5mM EDTA 500mM NaCl 1% SDS pH 7.5);饱和酚;氯仿/异戊醇;异丙醇;70%及无水乙醇;3M NaAC(pH5.2);RNA 酶;TAE缓冲液;载样缓冲液

三:操作 动植物材料10g(鲜组织) 0.5g(干冻组织)

液氮,研碎,10ml裂解液(含1/10体积酚),(65℃预热), 加入等体积氯仿, 65℃放置30分钟,间隔5-10min轻摇一次,离心(12000-15000rpm, 15min )

上清液

静止下

0.6体积冷异丙醇,0.1体积3MpH5,2乙酸钠, 挑取絮状体, 70%冷乙醇洗涤,真空干燥,2mlTE(或水)+10ulRNase,65℃,10-30分复溶和除RNA

等体积酚/氯仿,氯仿抽提(轻轻混匀、冰浴沉淀5min,5000RPM离心5min,取上清)

上清液

2V无水乙醇、1/10VnaAC,-20,2或-80℃,30min 10000RPM,10min

沉 淀 70%冷乙醇洗涤  真空干燥

干粉-20℃保存,或复溶于0.5-1mlTE或水中,分装成小体积, -20℃或4℃保存

四:鉴定

所提DNA 进行Agarose胶分析(电泳过程见附),紫外观测仪观测,凝胶成像系统拍摄。

注意:

1.裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA 溶解

2.酚一定要碱平衡

3.各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA 的人为降解

4.取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰.

5.异丙醇,乙醇。NaAC,KAC等要预冷,以减少DNA 的降解,促进DNA 与蛋白等的分相及DNA 沉淀。

6.本方法适用于以DNA 片段的酶切分析、Southern印迹等中,具有快速、省时、省线的特点。

7.此方法也适合菌类基因组 DNA 的大量提取。

附件列表


→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条

上一篇Agrobacterium growth and transformation 下一篇质粒纯化

词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
0

收藏到:  

词条信息

admin
admin
超级管理员
词条创建者 发短消息   

相关词条