原理

基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子)或下游序列的方法。其原理如下：首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性内切酶消化基因组 DNA，然后将预先设计好的 DNA 接头连接在 DNA 的两端,这样的一组两端带有接头的 DNA 片段就称为所谓的无载体的 DNA 文库；根据接头和目的基因的序列设计两组引物，以上述的DNA为模板，先以外侧的一组引物进行第一轮 TD-PCR (touchdownPCR )扩增，然后以内侧的一组引物进行巢式 TD-PCR 扩增，扩增产物即为所需的DNA片段。在接头中，由于2条链中较短的一链的3’末端被 2NH₂ 封闭，使得引物 AP1 在第一次 PCR 之前没有结合位点，在 PCR 的第一循环过程中只能从 GSP1 延伸，没有 AP1 的延伸产物。而GSP1 的延伸产物产生了 AP1 的结合位点，在第二循环就开始从两端进行延伸反应。这样，就减少了非特异性扩增，从而提高了 PCR 的特异性.基因组步行由 2 轮 TD-PCR 反应组成。在 TD-PCR 的初始循环中，所采用的退火和延伸温度比引物的 Tm 值略高，在这种情况下引物退火的效率会下降，但是特异性将增加；另外，在极少数情况下接头的 2NH₂ 也会延伸，补平接头，这样也产生了 AP1 的结合位点，从而增加了非特异性扩增，但在高温下，接头的自我退火比引物与接头退火的效率高，就提高了针对于 AP1 的 PCR 抑制效应，减少非特异性扩增。在随后的循环中，退火和延伸温度比 Tm 值略低，有利于特异性产物的指数增长。基因组步行技术主要应用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆，该技术也可用于确定内元/外元的连接以及从任何序列标签位点(Sequence2tagged site,STS)或 EST 两端进行扩增获得相应的序列。尽管一次步行获得的片段长度短于 6 kb，但可通过多次反应获得更长的片段。该方法对于填补基因组中的一些间隙，特别是当这些缺失的克隆通过常规的筛选文库很难得到时非常有。

一、高质量基因组DNA 的提取

1 材料

实验鱼，尾静脉取血100 μl(含抗凝剂)

2 试剂

QIAGEN Genomic 20/G；Tip Holders；Buffer C1；Buffer QBT；Buffer QF 抗凝剂 : 0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖

3.方法

1）样品的处理和裂解

(1)将100μl鱼血用PBS稀释至1ml

(2)加入1倍体积冰冷的Buffer C1，3倍体积（3ml）的ddH₂O 。

(3)翻转数次至悬冷液成半透明

(4)冰浴10min。

(5)4℃，1300g离心15min，弃上清液。

(6)加入250μl冰冷的Buffer C1，750μl冰冷的ddH₂O。

(7)轻弹，溶解沉淀。

(8)4℃，1300g离心15min，弃上清液（如沉淀不是白色，重复洗涤步骤）。

(9)加入1ml Buffer G2，最大速漩涡10-30s，充分重悬核酸沉淀物（时间要控制得很严格）。

(10)加入25μl QIAGEN Protease，50℃保育30-60min（如有必要可延长保育时间）。

2）DNA的提取

二、基因组步行法扩增5’及3’侧翼序列

1 材料

基因组DNA

2．仪器、用具

离心机、PCR仪

3．试剂

(1)30μl DraⅠ(10units/μl)

(2)10μl T4 DNA Ligase (6units/μl)

(3)10×Ligation Buffer

(4)BD Genome walker Adaptor (25 UM )

(5)Adaptor Primer1 (AP1,10uM)

(6)Nested Adaptor Primer2 (AP2,10μM)

(7)酚

(8)氯仿

(9)3M 醋酸钠

(10)95%乙醇

(11)80%乙醇

(12)TE: 10 mM Tris,0.1mM EDTA (10/0.1,ph7.5)

(13)TE: 10 mM Tris,1mM EDTA (10/1,ph7.5)

4．方法

1）电泳检测基因组DNA质量

取1μl Genomic DNA (0.1μg/μl)和1 μl Control genomic DNA (0.1 μg/μl)，0.8%凝胶电

泳检测基因组DNA质量。

2）DraⅠ酶切检测Genomic DNA质量

(1)于0.5ml离心管中加入

(2)轻轻翻转离心管混匀(不要旋涡)。

(3)37℃过夜。

(4)取5μl反应液于0.8%凝胶进行检测，1 μl genomic DNA作对照。

3）基因DNA Dra I 酶切

(1)于1.5ml离心管中加入以下试剂：

(2)轻轻摇匀。

(3)37℃保育2hr。

(4)低速旋涡5-10s。

(5)37℃温育过夜(16hr -18hr)。

(6)取5 μl酶切产物于0.8%凝胶上进行电泳检测。

4）DraⅠ酶切 DNA 的纯化

(1)于1.5ml 离心管中加入等体积的 (95 μl)酚。

(2)低速旋涡5-10s。

(3)短暂离心分离水相和有机物。

(4)将上层水相吸至另一新1.5ml 离心管中，弃下层有机物。

(5)加入等体积 (95 μl)氯仿。

(6)低速旋涡5-10s。

(7)短暂离心分离水相有机物。

(8)转移上层水相至另一新1.5ml 离心管中，弃下层有机物。

(9)加入2 倍体积 (190 μl)冰冷的95%乙醇。

(10)加人1/10 体积 (9.5 μl)3M NaAc (pH4.5)。

(11)低速旋涡5-10s (轻弹)。

(12)14000rpm，离心10min。

(13)倒掉上清，空气干燥沉淀。

(14)加入20 μl TE (10/0.1 pH7.5)溶解沉淀

(15)低速旋涡5-10s (轻弹)。

(16)1 μl纯化产物于0.8%凝胶进行电泳检测。

5）Genomic DNA 与 Genomewalker Adaptor 连接

(1)于0.5ml 离心管中加入

(2)16℃过夜

(3)70℃保育5min

(4)加入TE 72 μl (TE 10/1 pH7.5)

(5)轻弹5-10s

6）PCR

(1)1st PCR

① 配制PCR反应液

② 反应条件: 94℃ 25s，72℃ 3min ×7；94℃ 25s，67℃ 3min ×32；67℃7min。

(2)2nd PCR

1)取1 μl 1st PCR 产物49 μl ddH₂O 中，稀释50 倍

① 配制PCR反应液

② 反应条件: 94℃ 25s，72℃ 3min ×5；94℃ 25s，67℃ 3min ×20；67℃7min。

(3)取5μl 第二轮PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。回收纯化电泳片段克隆到pMD-18T载体，进行鉴定和测序。

(4)获得基因组DNA 5’及3’侧翼序列后，将其与基因组DNA 的核心片断进行拼接。这就获得了基因组DNA的全序列。

注：基因组步行法扩增5’侧翼序列和3’侧翼序列的方法相一致，只是PCR反应所用的接头引物和基因特异引物不同。