FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FISH的操作。

探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb-400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原-抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。

FISH检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。

我们以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例，简要介绍FISH的原位杂交过程。AneuVysion多色DNA探针试剂盒用于羊水细胞的产前诊断，样本是来源于羊水的细胞。试剂盒通过两组5种探针（LSI13/21和CEP18/X/Y）同时检测5个染色体的数目异常，以此为依据进行产前诊断。

样本的制备

1. 1000转/分离心羊水（AF）5分钟。羊水应没有血色或褐色。

2. 用2-5ml的1×胰酶/EDTA溶液（0.05%胰酶，0.53MEDTA4Na的Hank氏平衡盐溶液，不含CaCl₂、MgCl₂.6H₂O、MgSO4.7H₂O）悬浮沉淀，37℃水浴15分钟以上

3. 1000转/分离心5分钟

4. 用2-5ml的0.56%KCl溶液悬浮细胞，37℃水浴20分钟。这些处理步骤的目的是使羊水细胞成为悬浮的单细胞。

5. 加0.8-2ml的固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）至细胞低渗液中，轻轻混匀

6. 1000转/分离心悬液5分钟，用1ml新的固定液重新悬浮细胞。4℃保存固定的样本30分钟以上，直至FISH检测前。若要长期保存，-20℃保存在固定液中

7. 制片前根据悬浮细胞数调整悬液的体积。若储存时间超过一个月以上，在制片前用固定液清洗细胞

8. 直接滴加细胞悬液至1-2片预冷的玻片上，每片2个杂交区（每个区域15-25焯细胞悬液）

样本的老化（目的是为了使FISH达到最佳效果）

1. 将样本片子放入2×SSC 37℃1小时

2. 将片子放入新制的胃蛋白酶工作液中（20ul 10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl）37℃13分钟

3. 用磷酸盐平衡液（PBS）室温下清洗5分钟

4. 将片子放入快速固定液（0.95%甲醛：1ml的37%甲醛，0.18gMgCl2和39ml的PBS，4℃保存，一个月内使用）室温5分钟

5. 在室温下用PBS清洗5分钟

6. 晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片

7. 将片子浸泡在70%的乙醇中。用乙醇冲洗1分钟

8. 从70%乙醇中取出，依次放入85%、100%乙醇中重复以上步骤

9. 根据需要降解片子

样本DNA的变性

1. 片子的制作前将湿润的杂交盒（盒的边缘用1×3英寸的杂交膜或杂交纸密封）放入37℃孵箱内预热至37℃

2. 在科普林氏染色缸中加入变性溶液，73±1℃水浴30分钟以上。使用前测量温度。

3. 每次使用前测定变性溶液的PH值，确保在7.0-8.0之间。将样本片子浸泡入73±1℃变性溶液中5分钟降解样本的DNA。每个染色缸中的片子不能超过4张。

4. 用镊子拿出片子立刻放入室温的70%乙醇洗液中，漂洗片子除去甲酰胺。片子放入乙醇溶液中一分钟

5. 从70%的乙醇中拿出片子，依次放入85%、100%乙醇中重复上述步骤

6. 用吸水纸从玻片的底部吸去多余的乙醇，并抹干片子的外缘

在加入探针溶液前将片子加热至45-50℃2分钟（不得超过）

注意：假如在探针准备杂交前，片子的闲置会超过2分钟，请将片子放入盛有100%乙醇的染色缸中保存。在预热前不要让片子干燥

探针的预备

1. 让探针加热至室温，降低探针的粘度，使用合适的移液管

2. 振荡混合。用微型离心机将内容物离心（1-3秒）至底部。轻轻振荡再次混匀

3. 注意：该探针已经经过变性可直接与样本片子反应。若探针是非降解型，需进行73℃5分钟的变性

杂交

1. 在片子上，将10ul的CEP18/X/Y混合探针加到一个反应区，将10斓奶LSI13/21混合探针加至另一个反应区。将22mm×22mm的盖玻片立刻覆盖反应区，使探针溶液弥漫整个覆盖区。气泡会干扰杂交，因此必须排除气泡

注意：在盖玻片覆盖前，不能在多目标区加探针溶液；盖玻片应37℃预热

2. 用树胶封片：用5ml的注射器吸去树胶，在盖玻片的四周加上树胶

3. 将封好的片子放入37℃预热的杂交盒中，盖紧盖子，37℃孵育6-24小时

杂交后的冲洗

1. 在科普林染色缸中加入0.4×SSC/0.3%NP-40。将染色缸放入73±1℃的水浴中半小时以上，使0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度达到73±1℃。每批使用前都必须确保0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度达到73±1℃

2. 在科普林染色缸中加入2×SSC/0.1%NP-40，放置至室温。两种洗液使用过一天后就应丢弃

3. 挪去树胶和盖玻片，将片子立即放入73±1℃装有0.4×SSC/0.3%NP-40的科普林染色缸中，漂洗3秒左右。其他片子同样操作，然后孵育2分钟。不要同时操作4片以上。假如操作4片以上，取保0.4×SSC/0.3%NP-40的温度在73±1℃

注意：在洗浴前不能揭去盖玻片。当最后一片进入洗液后，开始计时2分钟

4. 将片子放入装有2×SSC/0.1%NP-40的科普林染色缸中室温放置5-60秒，漂洗1-3秒

5. 在暗处风干（一个关上的抽屉或是柜子就可以满足要求）

6. 加入10焯DAPIⅡ复染，盖上盖玻片。暗处避光保存

储存

在暗处-20℃保存杂交玻片。玻片在上述的条件下可以保存超过12个月而不影响荧光信号的强度。为了长期保存还可以用盖玻片密封防止干燥。片子存放于-20℃下

FISH结果的观察

在荧光显微镜下观察时，应先对片子的适用性进行评估。评估的标准如下：

• 探针信号的强度：信号应该明亮、清晰和容易分辨。信号是明亮紧凑的卵圆形或纤维状，弥散的卵圆形

• 背景：背景应该是黑色，没有粒状或是朦胧的荧光

• 交叉杂交/目标特异性：探针应该特异性地只和目标DNA结合。

假如出现上述任何一种达不到标准，应重新进行杂交。

选择最好的视野区，计数细胞核

用25倍物镜观察杂交区样本的分布。选择样本分布稀疏的区域，在此区域内没有间期核或中期扩展的重叠，可以观察到部分的间期核。避免选择细胞密集、重叠或核的边界模糊无法辨认的视野。避免视野下出现成团的细胞。只计数信号不连续的细胞。

计数扫描：

用40倍或63倍的物镜，从选择区域的左上开始计数，从左往右，计数中期扩展和间期核边缘的信号数。依据荧光信号的计数结果，结合染色体计数标准作出正确的诊断。

注意：以上介绍的步骤由Gene公司提供，仅供参考，具体的操作以产品说明书为准

为了进一步简化操作，Vysis公司还推出FISH杂交仪和自动预处理系统，配合AI公司的染色体扫描计数系统，更能使FISH检测和分析实现自动化，大大节省了研究者的时间和精力。

FISH检测的操作简便，但是这并不意味着随便。相反，FISH对检测的条件要求很高。检测过程中的温度、试剂的酸碱度，反应的时间都会对结果产生影响。因此在操作中应注意：

• 杂交前样本的老化相当重要，尤其是胃蛋白酶的浓度、消化的时间掌握不好，直接影响杂交的效果。若消化过度，细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片；若消化不足，则显示持续的自发荧光或者差的DAPI染色

• 操作过程中的温度控制应严格按照产品说明书，而且在反应前把液体预温到所要求的温度，检测中所使用的设备例如盖玻片、载玻片都应注意预热

• 各步骤时间应准确，每次操作都要迅速

• 为防止淬灭，杂交后的洗脱和晾干要注意避光。可以加入抗淬灭剂

• 此种片在-20℃避光保存1周。若要长期保存，应加入抗淬灭剂

只有细心的操作，FISH才能真正成为准确而简便的诊断工具。