在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。在发光免疫技术中常用的化学发光底物有以下几类。

1、氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：

鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。异鲁米诺衍生物ASEI和ABMI等也是常用的标记物。

2、吖啶酯（acridiniumester，AE）类类发光剂不需催化剂的存在，在有过氧化氢的稀碱溶液中即能发光。反应式如下：

电化学发光原理

上式反应迅速，在1～5s内即可完成；具有背景低、信比高的优点，其检测极限可达5×10^-9mol，发光量与AE浓度呈良好的线性反应，是一类的标记物。

3、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）反应在电极表面进行。发光底物为三联吡啶钌[Ru(bpy)32+]，另一反应物为三丙胺（TPA）。在阳电极表面，以上两化学物质可同时失去电子发生氧化反应（上图）。二价的Ru(bpy)₃²⁺被氧化成三价Ru(bpy)₃³⁺，TPA被氧化成阳离子自由基TPA^+●，后者失去一个质子（H⁺），成为自由基TPA^●，这是一个强还原剂，可将一个电子递给三价的Ru(bpy)₃^2+*，而TPA自身被氧化成TPA氧化产物。激发态的Ru(bpy)₃^2+*在衰减时发射一个波长为620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy)₃²⁺。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使信号得以增强。