重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术(Recombinant DNA Technique)是人类根据需要选择目的基因(DNA片段)在体外与基因运载体重组,转移至另一细胞或生物体内,以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用,关键在于限制酶的发现和应用。 一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases),又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶(“分子手术刀”)。 发现于原核生物体内,现已分离出100多种,几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 1、限制酶的命名 根据其来源命名。如: EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列,称为限制性位点或切点。 部分常用限制酶及切点 |
互补末端连接 产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式: 1)用同一种限制酶切割; 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割; 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。 3、特点: 根据上述限制酶的特点,在基因工程和基因诊断中的重要用途: 1) 不论DNA的来源如何,同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) 用于人类基因组的DNA分析,具特定的酶切位点。 3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。 二、基因运载体及其选择 载体(Vector):将外源目的DNA导入受体细胞,并能自我复制和增殖的工具。 载体具以下特征: 1)分子量小,便于携带较大的DNA片段,能进入宿主细胞并在其中增殖; 2)有多种限制酶切点,每种限制酶最好只有单一切点; 3)被切割后的载体,插入外源DNA后,不影响其复制能力,并有可选择的标记基因(如,抗药基因)。 常用的载体有:质粒,λ噬菌体,粘粒,BAC,YAC,PI等。 |
(一).质粒plasmid Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 常用的质粒如pUC19,多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中,随质粒的表达而表达,增殖而扩增。外源基因插入到MCS后,β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因,则产生兰色。从而筛选阳性菌落。 (二).λ-噬菌体(λphage) 是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久,COS序列碱基配对环化。 改建后的λ噬菌体发展了多种较大型的克隆载体,如: 1、置换λ载体 – 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。 2、插入λ载体 – 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制,然后包装成噬菌体,裂解宿主,释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。 裂解途径 |
(三).粘粒(cosmid vector)(30~40kb) 是将质粒和λ噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid –而得名Cosmid。改建后的粘粒含有λ噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后,在体外包装进而被克隆。可包装30~45kb长的DNA片段,多用于基因文库构建。 (四) 大片段DNA克隆载体 人类和哺乳动物的基因组很大,甚至许多单个基因也相当大(如:DMD gene 2300kb) ,克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体:BAC,PI,YAC等。 1、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC) 优点:能携带大片段DNA,约300kb。 在每个细胞中,一个载体分子能繁殖多个拷贝,高产DNA。 缺点:会出现插入片段在结构上的不稳定,导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点,人们采用低拷贝数复制子载体,如,E coli中的F因子。此质粒含有2种基因(part A, part B)。每个E coli能接受 >300kbDNA片段。 2、噬菌体PI载体和PAC PI噬菌体与λ噬菌体一样,外有蛋白质壳。内含相当大的(110~115kb)线性DNA,并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化,扩增。 1994年,有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-----PAC。 3、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC) YAC 的主要功能成份有三: 1)着丝粒:mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2)端粒:保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3)自主复制序列(ARS)元件:是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列:2个端粒,着丝粒,ARS元件,与外源DNA连接成线性DNA分子,导入酵母细胞克隆。 |
三、DNA重组与分子克隆化 为获得所需的基因或特异序列,需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组,并用适当方法在宿主细胞中表达,扩增得到大量相同的DNA片段,称为DNA克隆,亦称分子克隆。 基本原理与过程: 1、分离纯化目的基因 2、目的基因 vector =重组DNA分子 3、重组DNA分子导入受体细胞,并在其内增殖。 4、筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆(cell clone),将转化的细胞置于琼脂表面,以刺激细胞克隆生长,这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体,故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。 5、分离重组DNA克隆:即收获扩增的培养细胞,并选择分离重组DNA。 分离纯化目的基因 目的基因 vector =重组DNA分子 重组DNA 和分子克隆 |
重组DNA和分子克隆的几种方法: (依目的基因的来源) 1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆 3、化学合成目的基因进行克隆 4、PCR体外扩增目的片段进行克隆 从基因组中分离目的基因在细胞中克隆 筛选含有重组DNA的细胞——细胞克隆(cell clone) 筛查含有目的基因的细胞克隆 |
四、目的基因表达 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增,获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。 重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA,蛋白质。 就是将目的基因与表达载体重组,导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物(蛋白)。 如胰岛素,干扰素;生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。(expression cloning). 目的基因表达
基因文库(gene library),应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的DNA克隆。 (一) 构建基因组DNA文库 |
(二)染色体特异的基因文库 ( chromosome specific library) (三)cDNA文库(cDNA library) cDNA文库构建: 特定组织细胞一定发育阶段总mRNA |
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