碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理，仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时，则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化，该方法具有快速，条件温和，重复性好，载体物质可以再利用等优点，因而已广泛用于质粒DNA纯化。

1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。

2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。

3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。

4、以1ml流出液为1份进行收集。

5、对每一管测定其OD260值，以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。

6、合并所有含质粒的洗脱液，用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提，4℃下12000g离心2分钟，将上层水相转入新管。

7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟，然后4℃下12000g离心10分钟，弃去上清液。

8、沉淀加70%乙醇洗涤，4℃下12000g离心10分钟，弃去上清液。

9、 沉淀真空抽干，重新溶于TE或无菌水中。

[注意] 在装柱过程中，要防止柱床中出现断裂或气泡现象，要使界面保持平整。对新装成的柱，应用含0.1% SDS的TE平衡， 以使柱内的凝胶均匀。