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骨髓基质细胞的原代培养

标签: 骨髓基质细胞 原代培养

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材料方法

1.材料:

1.1材料来源:取自健康成人行骨髓内固定术扩髓前收集骨髓腔内骨髓。

1.2主要试剂:

DMEM培养基

胎牛血清(FBS)

β-甘油磷酸钠(β-GP)

维生素C

青链霉素

胰蛋白酶(1:250)-EDTA

1.3主要仪器设备

双人超净台 Farma Scientific美国

单人超净台 Farma Scientific美国

二氧化碳孵箱 Farma Scientific美国

低温冰箱 Farma Scientific美国

倒置相差显微镜 Nikon 日本

细胞培养皿35Ф Corning 美国

6孔、96孔培养板 Corning 美国

2.方法

2.1原代细胞培养:于髓内钉内固定术扩髓前,用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓,置入预装有DMEM培养液的无菌50ml离心管带至实验室。1000rpm离心10分钟弃上层脂肪,取沉淀细胞加入适量DMEM, 22G针头吹打成单细胞悬液,细胞计数后按所需浓度接种于培养瓶或培养板,加入完全培养液(含青链霉素各100u/ml,体积分数10%的胎牛血清、β-GP 10mmol/L、维生素C 50ng/ml、高糖DMEM)置于37℃,含体积分数5%的CO2 湿化空气孵箱中培养,3天后半量换液,以后隔日全量换液,倒置相差显微镜每日观察细胞生化情况。

2.2传代培养:原代培养至7-8天,细胞接近80%融合倒出培养液,1×PBS清洗两遍,用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化细胞2分钟,镜下观察至细胞分离脱壁后,立即加入完全培养液终止消化,细胞刮刀刮除细胞,将瓶内液体吸入离心管,1000rpm离心10分钟,弃上清,加入完全培养液将细胞重悬,并混合均匀计数后接种于培养皿,行传代培养。

              

                

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