材料方法

1.材料：

1.1材料来源：取自健康成人行骨髓内固定术扩髓前收集骨髓腔内骨髓。

1.2主要试剂：

DMEM培养基

胎牛血清（FBS）

β-甘油磷酸钠（β-GP）

维生素C

青链霉素

胰蛋白酶（1:250）-EDTA

1.3主要仪器设备

双人超净台 Farma Scientific美国

单人超净台 Farma Scientific美国

二氧化碳孵箱 Farma Scientific美国

低温冰箱 Farma Scientific美国

倒置相差显微镜 Nikon 日本

细胞培养皿35Ф Corning 美国

6孔、96孔培养板 Corning 美国

2.方法

2.1原代细胞培养：于髓内钉内固定术扩髓前，用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓，置入预装有DMEM培养液的无菌50ml离心管带至实验室。1000rpm离心10分钟弃上层脂肪，取沉淀细胞加入适量DMEM， 22G针头吹打成单细胞悬液，细胞计数后按所需浓度接种于培养瓶或培养板，加入完全培养液（含青链霉素各100u/ml,体积分数10%的胎牛血清、β-GP 10mmol/L、维生素C 50ng/ml、高糖DMEM）置于37℃,含体积分数5%的CO2 湿化空气孵箱中培养，3天后半量换液，以后隔日全量换液，倒置相差显微镜每日观察细胞生化情况。

2.2传代培养：原代培养至7-8天，细胞接近80%融合倒出培养液，1×PBS清洗两遍，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化细胞2分钟，镜下观察至细胞分离脱壁后，立即加入完全培养液终止消化，细胞刮刀刮除细胞，将瓶内液体吸入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入完全培养液将细胞重悬，并混合均匀计数后接种于培养皿，行传代培养。