构建人VH基因节段文库 [器材和试剂] ● PCR试剂和设备 ● 自pHENl中天然scFv文库制备的scFv基因文库模板DNA(单链和双链DNA 10ng/ul) ● Genecle&n试剂盒(Qbiogene) ● PVH3FoR1引物: 5'-TCG CGC GCA GTA ATA CAC GGC CGT GTC-3' ● PVH3FORl引物: 5'-TCG CGC GCA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC-3' ● PVlJ5FORl引物: 5'-TCG CGC GCA GTA ATA CAT GGC GGT GTC CGA-3, ● LMB3引物 [方法] 1、配制3个各自独立的50ul PCR反应混合液,包含: ● 水,35.5u1 ● 20×dNTP,2.5ul ● 10×Vent聚合酶缓冲液,5.0ul ● LMB3引物(10pmol/ul),2.5ul ● FORWARD引物 (10pmol/u1),2.5ul ● scFv基因模板DNA(10ng),1.0u1 ● VentDNA聚合酶(2单位),1.0u1 2、在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃,5分钟。 3、以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次,扩增VH基因。 4、在1.5%琼脂糖胶上胶纯化VH基因文库并用Genecleall试剂盒提取DNA.将每种产物重悬于20ul水中。在1.5%琼脂糖胶上,与已知大小和浓度的标准对照品比较,测定DNA浓度。 |
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