Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。

第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。

第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。

注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。

第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

          ATP sulfurylase
PPi+APS —————————> ATP

          Luciferase，ATP
Luciferin —————————> oxyluciferin

光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

第五步——然后加入下一种dNTP。

在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。

利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

最佳化的Pyrosequencing

Pyrosequencing反应利用的是酶级连系统，简单且强有力，给出阳性或阴性结果，每种成份和参数已最佳化，以得到高度一致的结果，精确度为99%。

* 底物浓度已最佳化

* 选择了Apyrase的特异浓度，保证了所有的dNTP被降解，包括ATP和dATPS

* dNTP降解速率慢于掺入速率，有利于dNTP充分掺入

* ATP合成速率快于ATP水解速率，使的ATP浓度和光产生正比于掺入的dNTP数目

* 仔细控制的试剂，保证了足够的活性和质量

待测序模扳制备

通过PCR技术将待测序列扩增，其中引物之一在合成时用生物素标记。加入STREPTAVIDIN包被的磁珠于扩增的DNA中，DNA分子通过引物的生物素和STREPTAVIDIN包被的磁珠形成复合体。DNA变性后，带生物素标记引物的单链在磁场中得到纯化，然后就可用于与测序引物退火，以便进行测序反应。

PSQ 96系统系统工作流程

1.基因组DNA提取

2.设计和合成PCR引物，其中之一标记生物素; PCR反应

3.DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火

4.对含生物素的单链DNA的测序/基于测序的SNP分析及等位基因频率确定

PSQ96系统包含了进行上述工作（3-4）的仪器及配件、软件、试剂，系统的设计满足高通量、快速、精确和经济的要求。