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农杆菌感受态的制备和转化

标签: 农杆菌 感受态

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双元载体的农杆菌转化

1.1农杆菌感受态细胞的制备

1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管,5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min,去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中,每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105

取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min,-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min,接着冰浴2min,加入800mlYM液体培养基28℃,175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB 代替 ,第一次的 CaCl2 溶液可用溶液(0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl(7.0) 0.01 DTT)替代。

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