方法一: 效率非常高,一般可到10*8,好时可到10*9,特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。 实验试剂: A液:1M,MnCl2: B液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用无菌水配,配后不需灭菌; C液 称取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部转入细口试剂瓶,然后加入46ml三蒸水,轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎,然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。 取1管B液(0.6ml),全部加入C液(46ml)中,混匀后,再用1ml移液器加入3.3ml A液,混匀冰浴即可使用。 实验步骤: 1、划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。 2、 挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡(300 rpms)培养3-4小时。 3、将培养温度调至18℃剧烈振荡(3280 rpms)培养,其余与普通感受态差不多。 4、每管加入4ml TB缓冲液,轻轻振荡,使菌体重新悬浮。 5、加入280ml DMSO(可用国产分析纯),混匀后分装入1.5ml EP管,冰上静置15分钟。 6、用纱布将所有装有感受态的EP管包好,用棉线系好后放入液氮中速冻,在液氮中静置12小时以上。 7、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。 注意事项: 1、洁净是最重要的。无菌都无所谓,在操作台上可正常操作。 2、离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。 3、涂板不要觉得不匀而多次反复,轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可,特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。 4、涂完后建议空气晾干(20-30分钟)这样会减少卫星菌落出现。 5、预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。 方法二: 本法效率极高,建议大家采纳。 实验步骤: 1、液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5,JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落。 2、挑直径1-3毫米的单菌落*可多个,接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率。 3、在18度 150-250RPM 培养19-50小时。没有冷却摇床的可在室温,但不可高于37度。 4、OD600约0.4-0.8时停止培养,放在冰水中冷却10分钟。 5、4度,300RPM离心15分钟,回收菌体。 6、去掉上清后,用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮,在冷10分钟。 7、再次离心回收菌体。 8、用1/12.5体积的TB悬浮,添加最终浓度为7%的DMSO,再冷却10分钟9.0.1-1毫升分装,直接在液氮中冻上。 9、在液氮或-80度保存。 10、将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上,37℃培养活化。 11、挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基,18℃,200-250rpm培养。 12、当OD600=0.5-0.8时,用预冷的40mL离心管于4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。 13、用预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。 14、重复第4步操作。 15、用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO至终浓度7% 。 16、冰浴10min后,分装保存于液氮中。 |
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