利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1. 光谱：
光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。
λ＝C/ν
λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。
光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：
E＝h•ν
H——普朗克常数（ 6.624×10-27尔格•秒）
ν——频率
紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm～400nm。可见光区为400nm～800nm。
组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成：
E＝E¬0+E平+E转+E振+E电
E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。
分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。
按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：
E＝E2- E1＝h
E¬1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。
可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。
与吸收光谱有关的三种电子是：
⑴ 二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称σ 键， 构成 键的电子称 σ电子，如C－C、C－H键。
⑵ 平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称π 键，形成π键的电子称为 π电子，如C=C键。
⑶ 未共享成键的电子，称n电子。
各种电子跃迁所需能量大小的顺序是：
n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*
紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。
如下表所示：
电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系表
电子跃迁类型 例子 紫外吸收波长范围
σ→σ* C－H 100～150 nm
π→π*( 非共轭 ) C＝O ＜200 nm
π→π*( 共轭 ) ＝C－C＝ 200～300 nm
n→π* C＝O ～300 nm
π→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200～300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200～300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。
若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。
⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。
⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表示。
⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、¬肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。
测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。
常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。
紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。
发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝O等发色团。
助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。
增色效应（hyperchromic effect）:
核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。
减色效应（hypochromic effect）:
在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。
2. 光吸收定律：
朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律：
A＝－lgT＝εb c
A——吸光度，又称光密度“O.D”。
T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。
ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L•mol－1•cm－1）。
b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。
C¬——样品浓度（mol/L）。
由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
摩尔吸光系数： ， 是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 ε＝10～105：一般认为ε＞ 104为强吸收；ε＝103～104 为较强吸收；ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。
因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001, 所以，当b＝1cm,
ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8 mol/L。
常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%（W / V），液层厚度b＝1cm时的吸光度，以E1%λmax表示。
C——百分浓度（W / V）。
L——液层厚度，吸收杯光径长度。 A——吸光度。
最大吸收波长λmax时的ε 和E1%λmax值可用下式换算：
ε＝E1%λmax×分子量 / 10
吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：
A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝
即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。
若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例如，离子交换柱层析分离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率：
m＝C•V ， ∵ ， ∴
m——溶质的量 C——溶质浓度
V——溶液体积 A——吸光度
ε——吸光系数 b——吸收池光径
∴ 回收率 （100%）
（上式中假设ε总和各核苷酸的ε近似相等）
例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。
∵ A＝ εbC ∵ A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度）
∴ A＝0.650－0.070＝0.580 ∵ b＝1cm
∴ C==7.1×10－5 mol / L
例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度为24.9（1cm吸收池，280nm），计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度。
由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法计算浓度。
∵ ∴ ∴ C未知＝0.01％＝0.1mg / ml
1. 组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。
2. 构造：
⑴ 光源：
理想光源的条件是：①能提供连续的辐射；②光强度足够大；③在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；④光谱范围宽；⑤使用寿命长，价格低。
用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是320～1100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。
用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波长范围是195～400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。
⑵ 单色器：
单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：①入射狭缝——限制杂散光进入。②色散元件——即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。
③准直镜——把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 ④出射狭缝——只让额定波长的光射出单色器。
转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。
光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅，它又可分为平面反射光栅（即通称的反射光栅或闪烁光栅）和凹面反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝，得到锐线光谱。
光栅的刻制方法有两种：
机刻光栅：用金刚刀挤压镀于硬质玻璃上0.5~1的铝反射层而得。刻制工作量极大，一般每分钟只能刻10条线，刻100mm宽的600线/mm的光栅要100小时。最多刻到3600线/mm。由于其制造周期长，成本高，一般只能制得少量的母光栅，而实际应用的多是复制光栅，即在母光栅上涂上硅油，再镀上一层铝，用环氧树脂粘下来，就得到复制光栅。机刻光栅的缺点是线槽稍有缺陷时就会出现“鬼线”，即位于光谱强线两侧的模糊不清的假线。
全息光栅：用全息照相法刻制的高精度光栅。即用高强度的相干性极好的单色光，如激光，用高分辨的感光材料——光致抗蚀剂记录干涉条纹，曝光1小时，化学处理掉受光部分，再进行真空镀膜（镀铝），得到全息反射光栅。这种光栅几乎没有线槽间的周期误差，几乎没有“鬼线”，杂散光很少。最大线槽密度可达6500线/mm，最大直径可达400mm，刻线越多，分辨率就越高，最常用的是1200~1500线/mm的全息光栅。
狭缝、光谱频带宽度和分辨率：
出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽。
纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的“单色光”，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。 对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为0.1nm。
光谱有效频带宽度“b’”——是检测器检测到的光能量为峰值一半处的二点间的波长间隔，如下图所示：
光强度 P
b’ ——光谱有效频带宽（nm）
b ——狭缝宽度（mm） 1/2h
——线色散率 b’ 光谱有效频带宽b’
dλ——波长差 1/2h
dS——出射狭缝平面上二条 波长λ
光线（dλ）所分开的距离（mm）
由上式可以看出，b’与b成正比， 与线色散率成反比。线色散率越大，则可得到的有效频带宽度越小。
光谱有效频带宽度检查方法如下：
用钠光灯照明，在被测狭缝后测纳双线的光谱，并记录和测量放大了的纳双线光谱图。
589.6 nm 589.0 nm
75cm
5 cm 半峰宽 b’
因为光谱图由“nm”放大为“cm”，比例应不变：
∴ ∵ dλ＝589.6－589.0＝0.6 (nm)
∴ b’＝0.6×5／75＝0.04 (nm)
分辨率：是仪器对相邻的两个峰可分辨的最小波长间隔，是仪器分辨邻近二条谱线的能力。
分辨率 ：
例如若可分开钠双线：则
高的分辨率可达：R=105¬。
所以，狭缝宽度b越小，光谱带宽b’越小，分辨率就越高。
何种情况算是能够分辨：定义为二条谱线的峰与谷处于同一位置时，此二个峰认为是刚好能分辨。
由于光栅分光其色散是线性的，所以只用一种狭缝宽度对各种波长的光的测量，其分辨率都相同，即狭缝宽度不必经常调节。只要光强能达到要求，应使用尽可能小的狭缝宽度，以提高分辨率。
⑶ 样品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1℃，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05℃。
吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm～2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm～3000nm。
吸收池的形状有长方形，方形和园筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml），光程要求极精确，透光的玻璃面要严格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭头“→”，标明杯子使用时的透光方向，反方向使用会有偏差。
有各种用途的石英吸收池：如液体池、气体池、微量池（容积5μl～1ml）、流动池（测量连续流动的样品）、长光径池（测量稀溶液用）、可装拆池（便于清洗）等。
石英杯通常还配有玻璃或塑料盖，用以防止样品挥发和氧化，以及杯内样品的快速混合。
吸收池使用注意事项：
① 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1％洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。
② 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。
③ 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。
④ 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：
A= A1－A0
高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个杯子的偏差置零。
其他重要附件：高档分光光度计的样品室还可以更换各种重要附件，用于各种特殊量测。如换上“积分球”，可用来检测微弱透光和不透光的样品。换上“凝胶扫描装置”，可用于电泳凝胶胶条上样品带的扫描测量。
⑷ 检测器：
检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。
①光电管：光电管可检测10微微安（10-11A）的光电流，管内抽真空充入惰性气体，常用国产真空光电管有GD-5兰敏光电管（适用波长为210～625nm）；GD-6红敏光电管（适用波长为625～1000nm）。751型分光光度计即使用这两只光电管。
②光电倍增管：它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍，光电子由阴极到阳极重复发射9次以上，每一个光电子最后可产生106～107个电子，因此总放大倍数可达106～107倍，光电倍增管的响应时间极短，能检测10-8～10-9秒级的脉冲光。其灵敏度与光电管一样受到暗电流的限制，暗电流主要来自阴极发射的热电子和电极间的漏电。
③光电二极管：其原理是这种硅二极管受紫外～近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强或正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。尤其值得注意的是由于计算机技术的飞速发展，使用光电二极管的二极管阵列分光光度计有了很大的发展，二极管数目已达1024个，大大提高了分辨率。这种新型分光光度计的特点是“后分光”，即氘灯发射的光经透镜聚焦后穿过样品吸收池，经全息光栅色散后被二极管阵列的各个二极管接收，信号由计算机进行处理和存储，因而扫描速度极快，约10ms就可完成全波段扫描，绘出吸光度、波长和时间的三维立体色谱图，可以最方便快速地得到任一波长的吸收数据，它最适宜用于动力学测定，也是高效液相色谱仪最理想的检测器。
⑸ 显示装置：
低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。现代高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便（例如SPECORD 200）。
一、火焰的燃烧特性
着火极限，着火温度和燃烧速度是火焰的燃烧特性，常统称为火焰三要素。对于一个特点的燃气和助燃气混合气体，只有燃气在该混合气体中的百分含量处于某一范围内，燃烧才能开始，并扩展到个混合气体中，形成火焰。此燃气的含量的上下限称为着火极限。在着火极限内，燃烧能够自发地扩展到整个混合气体的最低温度，称为着火温度。可燃混合气体的某一点，其温度一但达到着火温度就开始燃烧，由于热传导作用，燃烧反应的混合气的这一点将传播到邻近气层，若初始反应产生的热量除了补偿由于热传导和辐射造成的损失外，还能将邻近气层的温度提高到它的着火温度，则燃烧反应持续下去，并以恒定的速度传播到整个可燃混合气。形成火焰。此传播速度就是该火焰的燃烧速度。火焰的三要素取决于可燃混合气体的性质和组成，初始压力和温度，燃烧器皿的结构和器壁的性质等众多因素。
在实际使用中，火焰的燃烧速度是三要素中最重要的因素，它直接影响着火焰的安全使用和稳定的燃烧。火焰的燃烧速度与气体成分、最初温度、湿度和气流速度有关。要使火焰稳定而安全地燃烧，应使燃烧速度等于或小于气流速度在火焰前沿上垂直分量，用数学方程式可表示为S<V*在实际工作中，通常要求气流速度比燃烧速度大3?0倍，当气流速度V燃烧速度S时，火焰前沿的法线与燃烧器轴线的夹角*增大，火焰将被吹灭；当V<S时，S指向燃烧器内，火焰向燃烧器内传播，产生“回火”爆炸。
气流速度取决于供气压力、燃烧器的结构和形状，对于常用缝式燃烧器，在给足的供气压力下，气流速度则取决于燃烧器的开口面积，缝宽而长，则气流速度小，反之则大。
二﹑火焰温度
火焰温度是火焰的主要特征之一，它对火焰中化合物的形成和离解以及待测元素原子化都起着重要作用。在火焰中，一方面可燃混合气根据其燃烧反应产生大量热能，另一方面，由于火焰中化合物的解离，以及为了将火焰中存在的平衡混合物提高到火焰温度要求消耗热量，还有火焰气体燃烧时产生的体积膨胀，也要消耗部分能量，这两方面的热能平衡决定了火焰温度。当火焰处于热平衡状态时，温度就可以用来表征火焰的真实能量。由于上述原因，在常压下，化学火焰的最高温度仅为3000℃左右。
当吸喷试液进入火焰时，火焰要消耗大量的热量来蒸发、分解试液溶剂，以及将分解产物提高到火焰温度，从而导致火焰温度的下降。如果溶剂是水，对于低温火焰，由于火焰分解水量小，这种降温效应不明显，但对于高温火焰来说，由于分解水量大，这种降温效应则十分显著，如果采用烙醇等有机溶剂作溶剂，因为它们在火焰中也能燃烧并释放出大量热能，将它们引入低温火焰，将有助于提高火焰温度，但对于高温火焰，它们则不能明显地提高火焰温度，仍以降温效应为主，所以为了保证火焰原子化的效果，在实际工作中应注意选择合适的样品溶剂和进液量的多少。
原子吸收光谱法所用的火焰一般都是在大气中直接燃烧的。从外界扩散至火焰中的气体发生解离也会影响到火焰温度。
所有反应都是强烈的吸热反应，解离时要消耗燃烧反应所产生的热量，降低火焰温度。对于原子吸收光谱分析而言，只有基态原子对原子吸收分析才是有效的。这就要求火焰必须具有足够的温度，以保证试样充分蒸发和待测元素化合物解离为自由原子。从这个意义上来说火焰温度应该越高越好，但是火焰温度提高后，火焰发射强度增大，多普勒效应增强，吸收线变宽、气体膨胀因素增大，从而使之相中自由原子浓度减少，导致测定的灵敏度降低。
此外，对于那些电离电位较低的元素，如Na、K、Rb和Cs，火焰温度高导致它们在火焰中产生严重电离，基态原子浓度降低。因此，在实际工作中，应根据试样性质和被测元素的物理特性来完成温度选择。
三、火焰组成
火焰的组成决定了火焰的氧化还原特性，并直接影响到待测元素化合物的分解及难解离化合物的形成，进而影响到原子化效率和自由原子火焰区中的有效寿命。影响火焰组成的因素较多，例如火焰的类型，同类火焰的燃助比，火焰的燃烧环境等。对于同一类型火焰，根据燃助比的变化可分为富燃焰、化学计量焰和贫燃焰。所谓化学计量焰是指燃助比例完全符合该燃气与助燃气的燃烧反应系数比。这种火焰温度最高，但火焰本身不具有氧化还原特性。富燃焰是指燃气大于化学计量焰的燃助比中燃气的火焰，这种火焰温度虽然略低于化学计量焰，但它由于燃气增加使得火焰中碳原子的浓度增高，使火焰中具有一定的还原性，有利于基态原子的产生；贫燃焰是指燃气小于化学计量焰燃助比中燃气的火焰，这种火焰温度较低，并具有明显的氧化性，此种火焰多用于碱金属等易电离元素的测定。
在原子吸收光谱分析中，使用较多的是富燃焰，经研究表明，在在空气-乙炔火焰中，当乙炔含量增加时，火焰中O、OH等气体分压降低，碳原子浓度增加，整个火焰还原性增强。当碳和氧的光原子比C/O=1时，火焰组成和性质发生突变，H2O 、CO2、 O2等气体分子从火焰中完全消失，O、OH等自由基浓度降低5?个数量级，碳原子增高4数量级，火焰发亮，若再进一步增加乙炔量，固体碳粒浓度增加，火焰更亮，但还原性保持不变而火焰温度下降。
使用有机溶剂喷入火焰，可以改变火焰的组成和特性。对于氢火焰，有机溶剂的引入只影响火焰温度，原因是氢火焰燃烧产物是水，而水火是不相容的。不过，若将有机溶剂引入烃火焰，它不仅可作为附加热源，提高火焰温度，而且更重要的是改变了火焰的组成和反应特性，根据有机溶剂内C/O比的不同，可将溶剂分为三类，C/O比大于1的是还原性溶剂，这类溶剂如C6H6、C2H5OH等，它们可以提高高火焰的C/O比，C/O比等于1的是中性溶剂如CH3OH，它的引入不会改变火焰中的C/O比，C/O比小于1的是氧化性溶剂，如HCOOH、H2O等，它们引入将降低火焰的C/O比。
四、火焰的透射性能
火焰的类型不同，其对不同波长的吸收能力不同，火焰本身的发射特性也不同，烃火焰在短波区具有较大的吸收，而氢火焰吸收较小，所以，对那些共振线位于短波区的元素，如As、Se、Pb、Zn、Cd等，最好采用空气-氢火焰，以减少火焰吸收的影响。空气-乙炔火焰在整个可见光区都有不同的发射信号，这些发射信号多来自火焰中激发分子的辐射谱带。氧化亚氮-空气有N分子谱带，这些发射信号使得火焰的噪声增加，测量准确性度下降。
五、几种常见的化学火焰
用于原子吸收光谱分析的气体混合物有：空气-氢气、氩气-氢气、空气-丙烷、空气-乙炔和氧化亚氮-乙炔等。采用氢气作燃气的火焰温度不太高（约2000℃）但这种氢火焰具有相当低的发射背景和吸收背景，适用于共振线位于紫外区域的元素（如As、Se等）分析。空气-丙烷火焰温度更低（约1900℃），干扰效应大，仅适用那些易于挥发和解离的元素，如碱金属和Cd、Cu、Pb等。实际应用最多的火焰是后两种火焰，目前为原子吸收分析所通用。
1﹑空气-乙炔火焰
使用空气-乙炔火焰的原子吸收光谱分析可以分析约35种元素，这种火焰的温度约为2300℃，空气-乙炔火焰燃烧稳定，重现性好，噪声低，燃烧速度不太多，有158cm/sec，但火焰温度较高，最高温度可达2500℃，作对M-O的离解能大于5ev的元素如AL（5.89）、Ti(6.9)、Zr(7.8)、Ta(8.4)等外，对大多数元素都有足够的灵敏度，调节空气、乙炔的流量比可以改变这种火焰的燃助比，使其具有不同的氧化-还原特性，这有利于不同性质的元素分析。空气-乙炔火焰使用较安全，操作较简单。这种火焰的不足之处是火焰对波长小于230nm的辐射有明显地吸收，特别是发亮的富燃焰，由于存在未燃烧的碳粒，使火焰发射和自吸收增强，噪声增大，这种火焰的另一种不足之处是温度还不够高，对于易形成难熔氧化物的元素B、Be、Y、Sc、Ti、Zr、Hf、V、Nb、Ta、W、Th、u以及稀土元素等，这种火焰原子化效率较低。
2、氧化亚氮-乙炔焰 也就是俗称的笑气-乙炔火焰，这种火焰的温度可达2900℃，接近氧气-乙炔火焰（约3000℃）可以用来测定那些形成难熔氧化物的元素。这种火焰的燃烧速度为160cm/sec，接近空气-乙炔火焰。使用这种火焰大大地扩展了火焰原子吸收光谱分析的应用范围，约可测定70多种元素。
氧化氩氮-乙炔火焰具有强烈的还原性，所以能减少甚至消除某些元素测定时的化学干扰。例如，采用空气-乙炔火焰测定Ca时，磷酸盐存在时产生干扰，测定Mg时，Ac产生干扰，但采用氧化亚氮-乙炔火焰测定，上述干扰全部消失，100倍以上的干扰离子不影响测定。氧化亚氮-乙炔火焰的原子化效率对燃气与助燃气流量的变化极为敏感，因此在实际工作中，应严格控制燃助比和燃烧器高度，否则，很难获得理想的分析结果。这种火焰不能直接点燃，必须先点燃普通的空气-乙炔火焰，待火焰稳定燃烧后，把火焰调节到稍富燃状态，然后迅速将空气切换成氧化亚氮，熄灭火焰时，也应先将氧化亚氮切换成空气，然后再切断乙炔供气，熄灭火焰，这一过渡过程必须严格遵守，否则该火焰极易回火爆炸。氧化亚氮-乙炔火焰在某些波段内具有强烈的自发射，使信噪比降低，该火焰的高温使许多被测元素产生电离现象，引起电离干扰。
1 概述
原子吸收分光光度法又称原子吸收光谱分析，是二十世纪五十年代提出，但在六十年代有较大发展的一种光学分析方法。该方法是基于测量气态原子对电磁辐射吸收而进行测定的分析方法。
原子吸收光谱的研究起源于对太阳光的观测。1802年渥拉斯通发现太阳光谱中存在许多黑线，以后弗兰霍夫详细研究了这些现象，但未阐明原因。因此，这些黑线也称弗兰霍夫线。1860年柯尔希霍夫对碱金属和碱土金属元素的发射光谱自吸现象的研究证实了基态的原子蒸气对于同种原子发射的电磁波的具有吸收作用，联系到弗兰霍夫线的位置恰好相当于某些化学元素发射的特征谱线的位置，从而说明这些黑线是由于大气层中的蒸气组分吸收了太阳辐射的某些波长的电磁波所造成的。1955年瓦尔西（Wals）正式提出原吸理论，1959年沃夫（Wolf）发明非火焰法（石墨炉），1965年威尔茨提出N2O－C2H4焰，70年代出现背景扣除技术。
原子吸收分光光度法：利用物质所产生的原子蒸气对特征谱线的吸收作用来进行定量分析的一种方法。
原子吸收分光光度法优点：
① 灵敏度高 10－10g（火焰）10－10（非）
② 准确性高，重现性好，<0.5%
③ 用途广
④ 样品量少（石墨炉5－１０ul ０.05~30mg）
⑤ 选择性好
2原子吸收分光光度法分析基础
一、 共振吸收线
原子受外界能量激发时，外层电子可跃迁到不同能级上，我们把电子从基态跃迁到第一激发态所产生的吸收谱线称做共振吸收线。
对不同元素，其原子结构和外层电子排布不同，因此，其共振吸收线的频率也不相同。即：共振吸收线是与元素的原子结构相关的特征谱线，共振吸收能量最低，最容易发生，一般原子吸收分光光度分析就是利用元素的共振吸收来进行分析的。
二、原子吸收基本定律（以火焰法为例）
锐线光源发射的共振线被基态原子吸收的程度与火焰宽度及原子蒸气浓度的关系符合朗伯－比尔定律。
即：吸光度A=log IOV / IV = KV CL
式中：IOV－光源发出的待测元素的共振线的强度
IV－被待测元素原子蒸气吸收后透射光的强度
KV－原子吸收系数
L－火焰宽度
原子吸收测试中一般固定火焰宽度，即L恒定。
所以 A= KV C 这是原子吸收的基本公式
一、 线轮廓与谱线变宽
1． 谱线轮廓
从原子吸收实验中观察到，原子对光的吸收不是绝对单色（即单一频率波长），而是有一定频率宽度。对于不同波长的光，原子蒸气吸收的程度不同，故IV随频率λ的变化而变化。吸收强度随λ或吸收系数随λ变化曲线，称谱线轮廓。
2． 谱线宽度
吸收系数等于极大值一半（1/2K0）处谱线轮廓上两点间的距离（即频率差）称吸收线的谱线宽度。
为什么吸收线会有一定宽度呢？
其一. 由于原子本身的性质决定（自然宽度）
其二. 由外因引起（如热、压力等）
3． 自然宽度ΔVN：无外界因素影响的情况下，谱线具有的宽度，这与原子发生能级间跃迁时激发态原子的寿命有关，即与原子本身性质有关，约10－5nm（根据测不准原理：激发态电子能量和跃迁时刻不可能同时测定，可推出能量测量差：ΔE•τ=h/2π hν= h/2πτ => ΔVN =1/2πτ τ：激发态原子平均寿命 ）
4．热变宽度（多普勒变宽）ΔVD
这是由原子在空间作无规则热运动而产生的多普勒现象引起的，
ΔVD=2V0/C（2ln2RT/M）1/2 = 7.16×10-7 V0（T/M）1/2
ΔVD ∝（T/M）1/2
式中：M －原子量 T －绝对温度 V0 －谱线中心频率
ΔVD =10-３ －10-４nm
5． 压力变宽
产生原子吸收的原子与蒸气中同种原子或其它粒子之间的相互碰撞引起的能级变化，从而导致吸收光频率改变而造成的谱线频率变宽的现象。
① 劳伦斯变宽（ΔVL）：待测原子同其它粒子相碰撞而引起的谱线变宽。
ΔVL=2NAσ2Р[2/πRT（1/A+1/M）]1/2 = Р[1/T（1/A+1/M）]1/2 约10-４－10-3nm
式中：NA －阿弗加德罗常数
σ2 －碰撞的有效截面积
Р－外界气体压强
T －绝对温度
A －相撞粒子质量 M －待测元素原子量
R －气体常数
② 共振变宽（ΔVH，Holtzmark变宽）：同种原子间碰撞引起的谱线变宽。
ΔVL是构成压力变宽的主要因素，ΔVH只有在高浓度时才显著。因此，一般情况下，谱线宽度主要由ΔVD和ΔVL构成，其中：火焰原子化器以ΔVD为主，无火焰原子化器以ΔVL为主。
谱线变宽对测量的影响：导致原子吸收分析灵敏度下降。
3原子吸收分光光度计
原子吸收分光光度计由光源、原子化器、分光系统、检测器和显示系统构成。构造上和其它分光光度计相似。原子化器相当于其它分光光度计中的吸收池，但结构上单色器在原子化器后面。
一、 光源
作用：提供（锐线）共振线
要求：①锐线
②共振线
③强度足够，稳定性好
种类：①蒸气放电灯
②无极放电灯
③空心阴极灯：阳极－钨棒
阴极－待测量纯金属
工作原理见书Ｐ294－295
二、原子化系统
作用：将试样中的待测元素转变为原子蒸气
种类：火焰原子化器、无火焰原子化器、冷原子化器、氢化物原子化器
① 火焰原子化器：由雾化器和燃烧器两部分构成，是最常用原子化器。
雾化器作用：将试样雾化
燃烧器作用：使试样原子化
火焰种类：ⅰ）空气－乙炔焰<2300℃ 适用于熔点较低金属原子化
ⅱ）氧化亚氮－乙炔焰 3000℃
ⅲ）氧－乙炔焰>2900℃
火焰种类的选择，应根据所测元素性质决定，使之原子化但不电离。
优点：重现性好，易操作，适应范围广。
缺点：灵敏度低（仅10%左右的试液被原子化）
② 无火焰原子化器
这类原子化器和火焰原子化器依靠可燃气体燃烧产生高温提供原子化能量不同，是依靠其它能量供给方式使样品原子化的。无火焰原子化器种类很多，如石墨炉、1CP、激光、高频感应加热炉等，使用最广泛的是石墨炉，测定时分干燥、灰化、原子化三个阶段程序升温。
优点：灵敏度高（试样全部原子化），检测限低。
缺点：干扰大，重现性差。
③ 氢化物原子化器
As、Sb、Bi、Ge、Sn、Se、Te等在酸性条件下，用强还原剂（K(Na)BH4）还原成挥发性的氢化物，这些氢化物在较低温度（<1000℃），就可分解成原子蒸气。
优点：选择性高，干扰少，灵敏度高（10－9），原子化温度低。
缺点：适用范围窄。
④ 冷原子化装置
Hg2+、 Hg+在还原剂SnCl2、盐酸羟胺作用下还原为Hg，Hg是低温元素，常温下蒸气压高，直接原子化。（10－8以上）
作用：测痕量Hg。
三、分光系统（单色器）
在原子吸收分光光度计中，空心阴极灯发射的光谱除含待测元素的共振线外，还有其它一些谱线，如待测原子的其它谱线（非共振线）、惰性气体谱线、杂质谱线、分子光谱等，这些谱线照射到检测系统上，就会影响到测定结果，因此，必须将这些谱线分开，这就要借助单色器。
单色器作用：将待测元素共振线每邻近谱线分开。
单色器构成：色散元件（光栅、棱镜）、反射镜、狭缝等组成。
S1－入射狭缝，S2－出射狭缝，Ｇ－色散元件，Ｍ－凹石反射镜（准直镜）和紫外－可见光中的连续光源不同。原子吸收所用的是锐线光源，谱线较简单。因此，不要求单色器很高的色散能力，由于激发原子数量<1%，为便于测定，要求一定的出射强度。因此，需选用适当的色散率的光栅与狭缝宽度相配合，构成适用的测定通带（带宽）。
定义：通带宽ω=D•S×10－3 式中 ω－通带宽度（nm）
Ｄ－色散率的倒数nm/mm
Ｓ－狭缝宽度（um）
S↑，IV↑，但分辨率↓，背景辐射↑，Ａ偏低，曲线弯曲，负误差。
S↓，IV↓，但分辨率↑，背景辐射↓，Ａ偏低，曲线弯曲，负误差。
一、 检测系统
作用：光信号转变为电信号
二、 仪器分类：
1． 单道单光束
2． 单道双光束
3． 双道（多道）双光束
三、 仪器的性能
原子吸收分光光度计的种类很多，衡量仪器性能的参数主要包括：灵敏度、特征浓度、检测极限、波长精度、分辨率等。
1． 灵敏度（S） 1UPAC规定：被测元素浓度（C）或质量，改变一个单位时，吸光度（A）的变化量：即S=dA/dc 或S=dA/dm
2． 特征浓度（Sˊ）：能产生1%吸收或0.0044吸光度值时，溶液中待测元素的质量浓度（ug•ml－1/1%）
Sˊ＝C×0.0044/A 石墨炉Sˊ＝（CV×0.0044/A）Pg/1%
C：被测元素含量或浓度
V：进样量 P＝10－12g
3． 测限（D）：待测元素所产生的信号强度等于标准偏差三倍时，所对应的浓度或质量。即：DC＝（C/A）3σ或Dm＝（g/A）3σ
式中： C－浓度 g－待测样的量
σ－空白溶液进行10次以上测定吸光度所得到的标准偏差
A－待测试液吸光度的平均值
4． 波长精度 λ＝λ0±πnm
4定量测试方法
原子吸收定量测试方法主要有标准曲线法，标准加入法和内标法三种。
一、标准曲线法
方法：配制一组适当的已知浓度的标准溶液(五个以上)，由低浓度到高浓度依次测定其吸光度A，作A－C曲线，即标准曲线。在同样条件下测定未知样的吸光度A未，从标准曲线上找出待测元素的浓度（或含量）。
C1 C2 C3 C4 C3 C未
A1 A2 A3 A4 A5 A未
优点：简便、快速
缺点：基体效应（物理干扰）大，适用于组成简单的试样
注意：1、标准曲线应在线性范围
2、标准溶液应与试样用相同方法处理，使其组成尽可能一致
3、整个分析过程中工作条件始终保持一致
4、每次测定前应用标准溶液对标准曲线进行校正
二、标准加入法
当待测样品组成复杂（含量低时），标准溶液难以和试样组成一致，这时基体效应对测试影响大，往往采用标准加入法进行定量分析。
方法：等体积两份待测试样，在其中一份中加入一定量已知浓度的标准溶液，然后稀释至相同体积，并在相同操作条件下测定其吸光度，则有：
实际工作中很少采用计算法，而是采用4点以上作图。这种标准加入法称直线外推法。
Ax A1 A2 A3
Cx Cx+C0 Cx+2C0 Cx+3C0
优点：适合于组成复杂样品，可消除基体效应和某些化学干扰
不足：不能消除背景吸收的影响
注意：1、测量应在线性范围内进行
2、至少采用4点，且C 0最好与Cx相当
C
三、内标法
方法：每个标准及待测样中分别加入已知量的内标元素，然后同时测量待测元素A1和内标元素A2，以A1 / A2的比值绘标准曲线，从此标准曲线上可求出Cx。
C
要求：内标元素不存在试样中，原子化条件相似。
优点：可消除雾化系统和火焰等测试因素波动而产生的误差。
缺点：须用双道型仪器测量。
5干扰及其抑制
原子吸收分光光度法的干扰较发射光谱法少，但仍存在以下几方面的干扰。
一． 光谱干扰
1．与光源有关的干扰（相邻谱线干扰）
①与分析线相邻的是待测元素的谱线，这种情况下，不产生吸收，使标准曲线向下弯曲，分析灵敏度下降，负误差。若无相邻线，
则 T＝Ia/Io，若有这种相邻线，其强度为I′，
则T′＝(Ia＋I′)/(Io＋I′)
T′－T＝(Ia＋I′)/(Io＋I′)－Ia/Io＝I′(Io－Ia)/ Io (Io＋I′) > 0
∴T′> T，则A′< A 相同浓度，吸光度下降。
引起原因：常见于多谱线元素（Fe、Co、Ni等）
消除方法：减少狭缝
②相邻线不是待测元素谱线
A、不是干扰元素的吸收线，则和①效果相同，消除方法同①。
B、是干扰元素吸收线
a.样品中不含该元素，和①效果相同，消除方法同①。
b.样品中含该元素，则使标准曲线向上弯曲，正误差
T＝Ia/Io T′＝Ia/(Io＋I′)
T′－T＝Ia /(Io＋I′)－Ia/Io＝(－I′Ia)/ Io (Io＋I′) < 0
∴ T′< T，则A′>A
引起原因：阴极材料不纯或隋气引起，多见于多元素灯。
消除方法：选合适惰气，高纯度阴极材料。
2．光谱线重叠 正误差，假吸收
产生原因：干扰元素共振线和待测元素共振线重叠造成。
消除方法：另选分析线或分离干扰元素。
3．背景干扰（与原子化器有关的干扰）
①背景吸收：这种干扰均增加吸收值，产生正误差（包括分子吸收、光散射和火焰气体吸收三种）。
产生原因：A、火焰中成分对光的吸收称火焰气体吸收
B、某些很稳定化合物（原子化条件下不分解），如：卤化物、氧化物、氢氧化物、硫酸盐、磷酸盐等对光的吸收
C、固体颗粒的散射称光散射
消除方法：A、氘灯背景较正
B、邻近线扣除法
②背景发射：火焰本身或原子蒸气中待测元素的发射。
消除方法：调制消除，用交流电源或用斩光器使之变为交流电源。
4．连续背景发射（非锐线光源）
由灯质量引起，灵敏度降低，工作曲线弯曲。
二、 物理干扰（基体效应）
产生原因：待测试样与标准溶液在转移、蒸发等过程中的物理因素（粘度、表面张力、溶剂）等的改变的引起的干扰。
消除方法：标准加入法
三、 电离干扰
产生原因：由于电离作用导致基态原子数减少，灵敏度降低。
消除方法：①加入消电剂，K不变，[e]增加，故[M]增加
②降低火焰温度，K变小，[M]增加
四、 化学干扰
产生原因：待测元素和共存元素产生化学作用引起。
结果：生成难挥发化合物，使原子化率下降。
消除方法：①加入释放剂
②加入保护剂（络合）
③标准加入法
④分离
6测定条件选择
测定条件对测定灵敏度、准确性及干扰情况有决定性影响。主要测试条件有：
1．分析线选择：共振或次灵敏线
2．灯电离的选择
灯电流小，灵敏度高，但I过小则测量精确度差。
灯电流大，谱线宽度变大，灵敏度下降，灯寿命缩短。
实际工作中由A－i曲线选择
3．狭缝宽度
狭缝宽度变（过）大，稳定性下降，背景干扰上升。
以能排除光谱干扰和具有一定的透光强度为原则
4．原子化条件选择（火焰法）
①火焰类型：易电离→低温焰，难电离→高温焰
②燃烧器高度：外焰：氧化性，易电离 内焰：还原焰，背景吸收↑，中间层：中性焰，原子蒸气多，较好。
③助燃气和燃烧气比例：控制温度。
