任何一个生物学实验室都需要有清洗器皿和消毒等工作内容，需要使用大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器械、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，虽然其中的大部分物品在国外采用的是一次性用品，但国内大部分实验室仍以可反复使用的物品为主，因此，掌握清洗、包装和消毒知识，学会清洗、包装和消毒方法是学习和从事细胞培养工作必须的。
清洗和消毒不但能除去器皿表面残留的微量有毒物质，而且能改变玻璃表面性质，有利于细胞的粘着和生长。Rappaport(1960)证明玻璃表面性质与细胞的粘附和生长能力有关。她将细胞悬浮在一已知成分的人工培养液内，培养于含有不同成分的玻璃表面上。她观察到细胞在玻璃表面上的粘附率不同，软质玻璃比Pyrex硬质玻璃更适于细胞粘附，特别是玻璃表面的总负电荷和钠离子的含量与细胞粘附密切有关。Rappaport等将新的小瓶子浸在含有0.1%NaOH的0.01 mol /L乙二胺四乙酸钠盐溶液（EDTA-Na）中，121℃蒸汽消毒处理30分钟，倒掉溶液后用重蒸水洗涤，再用含有0.005%结晶紫溶液浸泡1小时，玻璃表面均匀染上紫色，表明小瓶的预处理恰当；然后再用含0.2mol/LNa2CO3的0.2mmol/L EDTA-Na溶液，121℃蒸气处理30分钟，缓慢降低气压，取出瓶子，用重蒸留水洗涤。经过这样处理后，玻璃表面质量便有很大的改善，可使各种类型的哺乳类细胞在其表面上粘附和生长。
现在国际上已提供由不同成分配制的、并经特殊处理的一次性玻璃器皿，已经消毒,购来后可直接应用。还设计有各种无毒的塑料容器，也是购来即用，用后即丢。这样可以减少工作人员的工作量，但是仍有不少需要清洗和消毒的工作。
表 已知的培养液中HeLa细胞在不同玻面上的粘附率（21小时）
玻 璃 型 号
Corning
7900
(Yycor) Corning
7740
(Pyrex) Kimble
N-51-A Brockway
Flinte
(Sani-Glas) Kimble
Standard
Flint Demuth
Flint
粘
附
率 <0.2
<0.2
0.9 2.0
< 0.2
0.9
1.1 1.1
0.6
1.2
2.1 1.1
3.8
2.1
2.3 4.9
3.9
2.1
1.5 5.0
4.3
4.7
2.6
表中接种细胞数均为5.2×105。
一、纯化水制备
组织培养术对水的质量要求是一致的。如果水的质量低劣，最终会影响到细胞生长和实验结果的准确性。所以高度净化水的制备是很重要的，而且是准备各种培养液或溶液时的先行工作。
配制溶液时应采用新的，具有电阻为1.5—2.0uΩ重蒸馏水。蒸馏水贮放时间太长久，电阻水平下降为0.6—1.0µΩ，甚至水中会含从贮藏瓶壁上溶解下来的杂质，如来自塑料瓶的有机物质或来自玻璃的离子等。因久存， 由于大气的CO2溶解而引起的电阻增加则是许可的。如果带有离子类或大分子类（微生物类的内毒素）就绝不能再用，应弃之。
在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放制备纯化水的装置。所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
纯化水的常用制备方法
1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
水中杂有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类，以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换树脂的处理可以除去。根据水中杂质的性质，可以采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常用的是将强酸性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂混合装入离子交换柱内，将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。去离子水再经过双重蒸馏器蒸馏得纯化水，用于配制溶液。
2. 超纯水装置制备纯化水
二、去污剂的选择和使用
要根据实验要求选择去污剂。肥皂水较常用，肥皂水有助于润湿器皿，对不可混合的液体能起乳化剂的作用，对固体物质起着离散作用。缺点是易与Ca2+和Mg2+以及硬水中的金属离子形成不易溶解的螯和物。碱性去污剂和含有重铬酸钾的硫酸普遍被采用。将玻璃器皿先浸于肥皂水，冲掉肥皂水后，再浸于硫酸洗液中过夜，然后用自来水冲洗、去离子水冲洗，此效果是比较理想的。
使用洗涤剂煮沸物品应注意事项：煮沸前的水面要高干器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）.若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升．．
三、清洗
离体条件下，有害物质可直接与细胞接触，细胞对任何有害甚至有益的物质十分敏感，极少量残留物就会对细胞产生毒性作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，使其达到不含任何残留物要求。因不同培养器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也有区别，现分别介绍如下：
（一）玻璃器皿类的清洗和包装
要达到最有效的洗涤，需注意以下几点：①用过的玻璃器皿，不要让它干掉，应立即浸泡在清水或消毒水中，以去除潜在的生物性危害；②挑选一种去污剂，对本工作有效，又易于漂洗；④用流水冲洗干净，再用去离子水或重蒸馏水漂洗；③洗过的玻璃器皿作倒立式放在干燥箱内烘干或自然凉干；⑤用牛皮纸或锡箔包装后，放置干净无尘处，待消毒玻璃器皿的清洗一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。
1.浸泡 新的或用过的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新的玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后5%盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往
附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。
2.刷洗 将浸泡后的玻璃器皿放在洗涤剂（不能用含沙粒的洗衣粉）水中，用软毛刷反复刷洗。刷洗中，要不留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。
3.浸酸 浸酸是将上述玻璃器皿浸泡到清洁液，又称酸液中，通过清洁液的强氧化作用清除器皿表面可能残留的物质。根据清洁液含硫酸比例，将清洁液分为强酸、次强酸和弱酸三种。根据需要配制、选用不同的清洁液。清洁液对玻璃无腐蚀作用，去污效果很好，是保证器皿洁净的关键一环。一般来说，新的或用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。浸酸时，器皿应完全被清洁液充满和覆盖。浸酸时间不能少于6小时，一般要过夜或更长时间。将器皿放入清洁液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣服。从清洁液中取出器皿时，应沥干清洁液，并将浸酸的器皿放入合适容器，如塑料盆中运输。
表 清洁液配方
配方成分 常用方 弱 液 次强液 强液
重铬酸钾（g）
清水（ml）
浓硫酸(ml)
硫酸浓度（v/v） 100
800
200
20% 50
1000
90
8% 100
1000
160
14% 60
200
800
80%
配制清洁时，操作者必须小心认真，戴耐酸手套和防护眼镜，并严格按下列方法进行。
（1）选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。
（2）按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中。（用玻棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。
（3）缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险（绝不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中）。
（4）自然冷却、备用。
新配制的清洁液呈棕红色。当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品；目前细胞培养实验室都定做一种专用耐酸塑料容器。
4.冲洗 刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗得干净，直接影响到细胞培养成败。冲洗可用洗涤装置，也可用手工操作。手工洗涤浸酸后的器皿时，每件器皿都至少要重复“注满水-倒空”20次以上或者每瓶灌2／3容积的自来水，振荡后倒掉，重复20次以上（尖滴管置量杯中冲洗），最后用重蒸水浸洗2～3次，晾干或烘干后包装备用。对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放2～5%盐酸中浸泡过夜等理化方法灭菌，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。
滴管类的清洗，消毒过程与吸管相同。滴管尖端易断碎，所以清洗包装时小心。
（二）螺旋盖的清洗和包装
玻璃瓶盖有衬以合成的橡皮或矽垫的铅制盖和聚丙烯盖。
1.铅盖 将铅盖浸于去污剂15分钟后，然后将其放在烧杯内，通入自来水漂洗，每15分钟，要搅动铅盖一次。再用去离子水冲洗。取出铅盖放在不锈钢篮内烘干。注意：铝制品在碱性的去污剂中不能超过30分钟，也不可用浸泡过铝制品的去污剂浸泡玻璃器皿。
2.聚丙烯盖 矽硅塞子 这种盖和塞子应按铝盖的方法浸洗。由于聚丙烯盖子易漂浮在水面上，所以应加些重量使其沉没。
清洗干净的盖子放在大培养皿内，盖子开口向下，用软纸包扎或用蒸气可透入的尼龙膜（Portex）包装。
（三）橡皮帽和橡皮塞的清洗
新的橡皮帽和橡皮塞在2%NaOH（约0.5mol/L）溶液中浸泡过夜或煮沸处理15分钟，用自来水冲洗；再用2%～5%HCl浸泡30分钟。再用自来水冲洗；最后用去离子水浸泡过夜再冲洗后烘干。用过的橡皮帽、橡皮塞则用沸水处理，清水漂洗，去离子水冲洗、烘干即可。
（四）橡皮管的清洗
新的橡皮管的清洗步骤同橡皮塞的清洗步骤。为了保证橡胶皮管内的清洗，可用注射器反复吸或放洗涤剂的方法进行冲洗。接在热水管上用热水冲洗去污剂，用去离子水冲洗后烘干。
用过的橡皮管则用热水冲洗，去离子水冲洗、烘干。
（五）塑料制品的清洗
塑料制品的特点是：质地软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。其清洗程序为：使用器皿后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签和50℃洗涤液刷洗→流水冲洗→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→蒸馏水浸洗三次→双蒸水中泡24小时→晾干备用。
（六）不锈钢除菌滤器的清洗
用洗涤剂刷洗新的或使用后的滤器→流水冲洗15分钟→去离子水浸泡24小时→三蒸水浸泡24小时→干燥备用。
（七）金属器械的清洗
新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最好用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先用酒精棉球擦拭干净，再煮沸或高压消毒以备下次使用。
(八)针头式塑料小滤器（注射式小滤器）
由塑料制成，分下、下两部分，上部分接注射器，下部分接滤过无菌瓶。洗刷时先将上下两部分松开，注意垫圈和垫片摆放的位置。处理同塑料器皿，晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，摆放于金属盒内或单独包装，高压灭菌后备用。
（九）玻璃漏斗式滤器的清洗
新的滤器清洗：将玻璃除菌滤器置玻璃滤器洗液（配制方法：取10g硝酸钠溶于盛有470ml蒸馏水的玻璃缸内，加入28.6ml浓硫酸混匀备用）中浸泡24小时→流水缓慢冲洗至pH5.5左右→用4倍体积的蒸馏水缓慢冲洗→再用重蒸水缓慢冲洗→烤干→包装、消毒，备用。
用过的滤器清洗：用过玻璃除菌滤器后，立即浸泡于水中（注意：千万不能使滤器干涸）过夜，流水缓慢冲洗24小时或更长时间，至滤面基本疏通时，50℃烤干，滤器再置于清洁液中浸泡24小时，或装满清洁液自然过滤。流水冲洗及其后的处理同新的玻璃除菌滤器。
四、包装
包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。
1.瓶类：硫酸纸罩以瓶口，外罩二层牛皮纸用绳扎紧。
2.小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可先单独用单层牛皮纸包装，再将同时使用的物品用双层牛皮纸包装到一块，用绳扎紧；也可将这些器械直接装入消毒盒内，消毒时打开排气孔，消毒后再关上备用。
3.吸管、滴管口用脱脂棉塞上（不要太紧或太松）装入消毒筒内或单独包装，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好口， 外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。
4.无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。
五、消毒和灭菌
污染，特别是微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因。细胞培养所用的培养基是微生物生长的最合适营养物，微生物在其中的生长速度要比培养的细胞快成千上万倍，并产生毒素和改变培养基成分、pH等，导致细胞生长停止，甚至死亡。因此，细胞培养中，必须保证细胞在无微生物条件下生长。通常，通过消毒灭菌（将已存在的微生物杀死）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来防止培养物污染。
目前，多采用物理方法和化学方法消毒灭菌，抗生素也是一种重要的灭菌手段，实践中需根据消毒灭菌的物品不同而选择合适的消毒方法。
表 常用消毒方法及选择
消毒灭菌物品 压力蒸气 干热 过滤 紫外线 化学气体 化学
消毒剂 电离
辐射 抗
生素
培养室、工作台 + + +
玻璃制品 + + +
金属器械 + + + +
塑料用品 + + +
橡胶制品 + + + +
培养用液 + + +
布类、棉类 + +
表 玻璃器皿等用具的消毒
干燥高温消毒 高压蒸气消毒
玻璃器皿 带有玻璃和硅胶管的用具
玻璃盖玻片 微形吸管的可丢弃的加样尖头
玻璃载玻片 Compu-pet用的分装管子
玻璃的巴斯德吸管 （勿须先真空和后真空）
玻璃吸管 滤净器-微孔的Sartorius
试管 有螺旋盖的玻璃瓶
石蜡 磁力搅拌棒
爽身粉 螺旋盖
剪刀、镊子、解剖刀 硅化玻管
注射器和金属注射针 橡皮帽、橡皮塞、矽硅塞、
布类包括口罩、衣服等
橡皮手套
醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜
Seitz、Selas、Ertel滤器
砂芯玻璃滤器
微孔滤膜
表 液体类的消毒和贮存
溶液及其消毒方法 贮 存 条 件
蒸气消毒a)：
琼脂
Bacto-蛋白胨
EDTA
20%葡萄糖
甘油
HEPES
乳白蛋白水解产物
Methocel
酚红
盐溶液（不含葡萄糖）
水
过滤消毒b):
氨基酸类
抗生素类
牛血清白蛋白（堆积式过滤器）
胶原酶
1-2%葡萄糖
谷氨酰胺
1mol/L HCl
NaHCO3
1mol/L NaOH
血清（堆积式过滤器）
血清丙酮酸100 mmol/L
转铁蛋白
胰蛋白酶
维生素类
其他消毒-水蒸气c):
羧甲基纤维素（carboxylmethyl cellulose）
室温
室温
室温
室温
室温
室温
室温
4℃
室温
室温
室温
4℃
-20℃
4℃
-20℃
室温
-20℃
室温
室温
室温
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
-20℃
4℃
a)蒸气消毒：分钟。
b)过滤消毒：0.2μm孔径滤板。
c)水气：100℃，30分钟。
（一）物理消毒法
1.紫外线消毒 紫外线（ultraviolet）是一种低能量的电磁辐射，可以灭多种微生物。其中，革兰阴性菌最为敏感，其次是革兰阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。目前多种紫外线灯直接照射培养室（空气、地面、工作台表面等）进行消毒，用法简便，效果好。
紫外线的消毒同紫外线的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随距灯管的距离增加而降低，照射剂量和照射时间成正比。因此，紫外灯同被照物之间的距离和照射时间要适合。如用离地面2m的30W紫外灯可以照射9m2的房间，每天照射2～3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2m以外时，要延长照射时间，2.5m以上则效果较差。紫外线照射工作台面的距离不应超过1.5m，照射时间以30分钟左右为宜。
紫外灯照射还受其他环境条件，如室温和湿度、空气清洁度、遮挡物、染菌量、紫外灯管的老化程度等影响。紫外线不仅对皮肤、眼睛有伤害，而且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不能开着紫外灯工作。
2.电离辐射灭菌 电离辐射灭菌是以放射性核素产生的γ射线或电子加速器产生的加速离子辐射物品以杀灭微生物的方法. γ射线由放射性核素60Co产生，加速粒子由电子加速器产生，两者均可对金属、塑料、橡胶、玻璃、陶瓷、人工医学制品等进行灭菌。其灭菌的优点是，灭菌时物品不会升温，尤其适用不耐热的物品灭菌；辐射的穿透力强，可直接对密封包装的物品进行灭菌；辐射灭菌方法简便，不须考虑限制因素。培养工作中所用的许多一次性器械、物品，如培养瓶、培养皿、培养板、注射器、移液器吸头、离心管等，都可用辐射方法灭菌。但由于电离辐射的诱变作用很强，因此，不适合消毒活的生物材料。另外，电离辐射灭菌需要专门设备，灭菌时须由专业人员指导和操作。
3.湿热灭菌 压力蒸气灭菌是最常用的灭菌方法。高温高压蒸气对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞和某些培养用液等都可用这一方法灭菌。
不同压力蒸气所能达到的温度不同，不同的消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。一般物品采用压力15lbf/in2(121℃),维持15～30分钟，培养用液和橡胶类物品采用压力10lbf/ in2(125℃),维持10分钟。
达到有效蒸气消毒还需注意以下几点：（1）蒸气消毒锅本身的洁净；（2）待消毒物的包装用品和包装方式，包装用品要有利于湿热蒸气的浸人和空气的流出，又可避免蒸气消毒后取出时空气浸入的污染。一般可用两层棉布包装，或用棉布做的布袋
表 不同压力蒸气所能达到的温度
压力
lbf/in2 温度
（℃） 压力
lbf/in2 温度
（℃）
5
10
15 108.4
115.2
121.0 20
25
30 126.0
130.4
134.5
包装。瓶子的螺旋盖要解松，再包扎好。有溶液的瓶口用棉花塞，外包纱布。放吸管的容器下面垫几层纱布，垂直放置，有利于空气流出。瓶内溶液体积不能满过2/3，在瓶上做好溶液面的标记，如有少量水分蒸发，用消毒蒸馏水补充；（3）待消毒物体在消毒锅内不能堆积太满，在物与物之间要留有空隙，使有利蒸气穿过；（4）消毒结束冷却过程，在锅门上标记已消毒的标签；（5）取出消毒物后，潮湿的布类等放到烘箱内烘干。溶液类则在消毒房间内取掉棉花塞，盖上消毒的螺旋帽或橡皮帽等。用布类包装过滤装置和橡皮管等，也要放到烘箱内烘干备用，否则，潮湿的包装物品表面易为微生物污染。
煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等优点。
4.干热灭菌 干热灭菌主要是将电热烤箱的物品室加热到160℃以上，并保持90-120分钟。
这种消毒法仅限用于一些不能直接与蒸气接触的物品，或不至于被高温损坏的物品。
高温消毒主要是尽可能使烘箱内物品受热均匀。一般160℃，120分钟干燥消毒相当于121℃，20分钟的蒸气温热高压消毒。由于干燥高温穿透较缓慢和不均匀，因此消毒时间从烘箱温度到达时起，至少要有90分钟。烘箱温度计的插入位置要适中，最好每层都有温度计。启动烘箱温度计的插入位置要适中，最好每层都有温度计。启动烘箱风扇有助热气循环。消毒时间终了时，关掉烘箱开关使逐渐降温后再开烘箱门，这一方面可能由立即开门使温度骤变会引起玻璃器皿的破损，另一方面也可能由于温度骤变引起收缩而把外界空气带进。
干热消毒与蒸气消毒一样，烘箱内物与物之间要留有空隙。装载物品要略远离加热器位置，避免局部温度太高，或由于温度太高引起包装纸和布被烧焦。
5.过滤除菌 过滤消毒大多用于遇热不稳定的试剂或培养液。根据液体性质，流速，含颗粒大小和除菌的要求而选择过滤方式。
（1）过滤介质的基本性质 组织培养技术中使用的滤器型号虽然多种多样，但过滤介质即过滤板的结构基本归纳为三种类型：深度过滤板（depth filter）、筛状滤板（screenfilter）和膜状滤板（membrane filter）。
深度滤板一般由纤维、颗粒性细碎材料紧压缠绕形成的板，板的两面间有一定的深度，形成具有曲折交错的液体流动渠道。纤维的粗细，颗粒的大小，压紧程度决定渠道的排列和粗细。石棉滤板属于这一类。用这种滤板过滤，一般压力限制在15-20磅，压力加大会使一些颗粒通过流动渠道到滤液中，使过滤消毒失效。深度滤板还有介质移动缺点，过滤时常有介质脱落。
筛状滤板可由多种材料制成，如不锈钢、镍、尼龙、聚脂等。孔径均匀，分布有规则，可按孔径大小不同定级。凡颗粒最小直径超过筛孔大小的，都不能通过。但上述材料编织的孔径最小的为2μm的筛板孔，对小于2μm的细菌无清除作用。玻璃漏斗式滤器属于这一类。
膜状滤板是用纤维素脂为材料制成的孔径大小从10μm到0.025μm的一系列孔径均一的薄膜，可直接用于除菌过滤。但由于过滤时，污物停留在膜的表面，所以去污力较低。当过滤大量的或污染严重的液体时，最好先用深度滤板过滤后再用滤膜过滤。滤膜耐高温，可干燥加热到200℃；也耐高压，经适当支撑后，滤膜可耐受至少10000磅的压差。可用高压蒸气消毒。
（2）比较正压与负压过滤除菌 正压过滤优点：流速高，过滤快；可将需过滤的液体直接滤到储存瓶内，不需要缓冲瓶，不会出现由于真空泵倒流而造成的污染；过滤蛋白质时可避免产生大量气泡；有利过滤沸点低的试剂。
负压过滤正相反。由于收集瓶是在真空状态下收集滤液，因此真空瓶与外界之间的任何微小通路都可能成为污染的来源。过滤沸点低的试剂，由于容器内呈真空，使试剂不断挥发。不过负压过滤较为方便，尤其是过滤体积较小的液体。
（3）过滤系统的设计和选择 市场上已有多用的过滤品出售。有金属的，也有塑料的过滤装置。还有不同型号的一次性的滤器产品，有注射器式，圆柱注射器式，具有直径为47mm圆盘滤器，以及“Twin90”等型号。
1）正压过滤系统的程序：① 首先选择合适体积的滤器，放好固定滤器的支架，将消毒部分和不消毒部分装配成一套正压过滤系统；
②将预备过滤的培养液等液体倒入压力容器瓶内；③将水泵打开，给予100kPa的压力，使培养液等通过滤膜过除菌，滤液导入消毒接收瓶内；④通过接收器出口，将消毒的液体分装入培养液贮存瓶内，加盖，贮存备用。
2）负压过滤系统程序：
①选择体积合适的滤器，将消毒部分和非消毒部分装配成一套负压过滤系统；②将预过滤培养液倒入滤器溶器内；③ 打开水泵或真空泵抽气，使真空瓶成真空，未消毒的培养液通过滤膜过滤到真空溶器瓶内； ④将消毒的培养液分装入培养液母液贮存瓶内，加盖，贮存备用。
表 滤器的大小和液体容量
滤器大小
直径（mm） 面积
（cm2） 可丢弃的（D）与可再用的（R） 可滤过的液体体积
晶体样 胶样
25
47
90
Twin-90
142
10×76
293 4.5
14
50
100
140
250
650 D
D和R
R
D
R
D
R 2-100ml
100ml-1L
1- 2L
2- 5L
10-50L
20-250L
50-500L 2-25ml
50-200ml
200ml-2L
未定
1- 5L
2- 10L
5-20L
应当注意的是，负压抽滤后拆除滤器前需解除真空。为了避免空气充入真空瓶内易造成污染，最好在连接真空滤液容器和真空缓冲瓶间的真空管道中间安装一个球形砂芯玻璃滤菌器，或0.5μm孔径滤板过滤空气，与真空滤液容器等一块包装消毒。
3）配有预过滤的过滤系统程序：有些液体如血清，需要通过0.2μm孔径滤膜过滤消毒。由于这种液体粘度大，并存在有颗粒样物质，因此直接通过0.2μm孔径的滤膜过滤有困难，所以应先通过一系列等级不同的预过滤，然后再过滤消毒。过滤5-10L胶样溶液。系列预过滤器可以是不锈钢网支持的软片型过滤器，孔径为5、1.2、0.45μm的过滤器，系列预过滤后，与一个消毒的附有0.2μm孔径膜的Twin-90滤器连接，最后连接到消毒的收集器。其余过滤程序与上述方法相同。
4）堆积式过滤装置：过滤小于1L的胶样溶液采用此系统，见图4-6，其余步骤同上述。
5）再用滤器的装配和使用：整套装配见图4-7。①整套是消毒的，未消毒的培养液可以直接放入滤器容器内，或通过加压槽将未消毒的培养液加入到容器内；②打开泵加压；其余步骤同上。
6）注射式的过滤器：当过滤10-20ml或少于50ml的血清或溶液时，可采用注射器式过滤器。夹有滤膜的滤板接到注射器上。一系列注射器型的滤板和滤膜都有商品出售。
（二）化学消毒法
化学消毒是利用化学消毒剂来消毒那些不能用物理消毒等方法进行消毒的物品和场地，如无菌室的空气、台面、操作者的皮肤等。细胞培养中常用的化学消毒剂包括甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯已定（洗必泰）、戊二醛、碘伏和碘酊、乳酸、来苏尔等。此外，市场上以各种商品名所称的化学消毒剂多为复合类制剂，可用台面、地面等的消毒，使用时按说明书进行。
1.甲醛 甲醛（methylaldehyde）是一种广谱灭菌剂，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。通常无菌室内的空气和物体表面灭菌就是利用甲醛加热或在甲醛水溶液（福尔马林）内加高锰酸钾等氧化剂后使用甲醛汽化，达到对空气和物品熏蒸的目的。甲醛灭菌时产生气体的方法有以下几种：
（1）多聚甲醛加热法：将多聚甲醛研成粉末，均匀铺在金属板上，加热至150℃以上即产生甲醛气体。多聚甲醛用量为每平方米10-20g，作用时间12-24小时。多聚甲醛产气量高，对室内相对湿度改变小，是较理想的方法。
（2）甲醛水溶液蒸发法：将40%甲醛水溶液（福尔马林）倒入蒸发皿中，加热蒸发。福尔马林的用量为每平方米25ml，作用时间12-24小时。
（3）氧化法：先将高锰酸钾放入一较大容器中，再倒入福尔马林，即氧化产生甲醛气体。福尔马林和高锰酸钾的用量为每平方米40ml和30g，作用时间以12-24小时为宜。如果为了增加空气的湿度可加入相当于福尔马林用量一半的水。
由于甲醛气体的穿透力差，故在熏蒸前应充分暴露物体表面，打开橱门，摊开或挂起物品。熏蒸时室内温度应在18℃以上，相对湿度为70%。甲醛气体对人体有毒,应在气体散尽后再进入室内工作。此外，4%-8%甲醛水溶液及8%甲醛乙醇溶液（用70%乙醇配制）可用于器械或物品的液体浸泡灭菌，作用6-18小时为宜。
2.环氧乙烷 环氧乙烷（ethylene oxide）气体具有广泛的杀菌作用，它不损害消毒物品，且穿透力强。主要用于消毒塑料用品、不耐高热高压以及不能受潮湿的物品。例如，培养板、塑料培养瓶皿、布类等。被消毒的物品可以用棉布或塑料薄膜包装后灭菌，大规模灭菌一般采用环氧乙烷灭菌袋进行。
由于环氧乙烷易燃易爆，放置和使用处应无火源，通风好，操作时应慎重，以免药液喷出或漏气，消毒后必须打开方可使用。环氧乙烷气体有毒，不可用于空气消毒。
3.乙醇 乙醇（ethanol）是一种应用广泛的消毒剂，消毒效果好，且对其他灭菌剂例如戊二醛、碘伏、氯已定（洗必泰）等有增效或协同作用。通常使用浓度为70%-75%的乙醇水溶液。由于乙醇不能杀死芽孢，所以，取材器械等物品一般不宜用乙醇浸泡消毒。此外，橡胶和塑料制品长时间接触乙醇会变硬。用75%酒精消毒塑料器皿的程序是：70%酒精浸泡过夜→灭菌三蒸水浸泡三次（10分钟/次）→无菌条件下晾干→紫外线照射1小时。
4.氯己定 氯己定，又称洗必泰（hibitane），化学名为1，6-双-（正-对氯苯双胍）-已烷，是广谱杀菌剂。其毒性低，刺激性小，不产生耐药性，是目前广泛应用的消毒剂之一。主要用于皮肤及创面消毒。用0.02%洗必泰的水溶液消毒（浸泡3分钟）及动物创面的洗涤消毒；用0.5%洗必泰的乙醇溶液（70%乙醇配制）擦手消毒和动物皮肤消毒。
5.戊二醛 戊二醛（glutaraldehyde）是一种广谱、高效灭菌剂。具有水溶液稳定、对金属腐蚀性小、低毒、安全等优点。通常用2%的碱性戊二醛溶液灭菌。配制方法：先将戊二醛原液稀释成2%（V/V）水溶液，再加入0.3%（W/V）NaHCO3，将溶液调至pH7.5～8.5，另加入0.5%亚硝酸钠可防锈和增效。用此溶液浸泡金属器械、温度计、橡皮和塑料管、塞等30分钟以上即可灭菌。灭菌后的物品须用无菌水冲洗。通常戊二醛溶液不会腐蚀和损坏上述物品，其溶液的表面张力低，容易穿透和洗去。
6.新洁尔灭 新洁尔灭，又称苯扎溴铵，其0.1%水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。
7.碘伏与碘酊 碘伏（iodophor）是一种广谱杀菌剂，能杀死细菌、芽孢、真菌、病毒等，且杀菌的速度很快，已在临床广泛使用。医用碘伏是聚烯吡咯烷酮-碘（PVP-I），可用于手消毒和手术野的皮肤消毒。也可将1%碘伏用于地面、台面及物品表面等的擦试或喷雾消毒。
碘酊又名碘酒(配制方法：20g碘、15g碘化钾(或碘化钠)、500ml95%乙醇、加水至1000ml)，主要用于皮肤消毒，皮肤经碘酒涂抹2～3次后，须用70%乙醇脱碘。
（三）抗生素消毒法
抗生素主要用于消毒培养用液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭的微生物不同，应根据需要进行选择。
可用于细胞培养的消毒灭菌方法虽然有多种，但每种消毒灭菌方法都有一定的适用范围。如常采用过滤除菌系统、紫外线照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用来苏尔或新洁尔灭消毒实验室地面；常用干热、湿热、消毒剂浸泡、紫外线照射等方法消毒培养用器械；采用高压蒸气消毒或过滤除菌方法消毒培养液。
为了防止清洗器材已消毒与未消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钴(CoCｌ2•6H2O)2g,30%盐酸10ml，蒸馏水88ml。
