检测原理
用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织或细胞的mRNA分别标记成不同的探针，将探针混合后与芯片上的基因进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。是基因功能研究的一种重要手段。
应用意义
对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以，无论何种研究领域，利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域。
采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点：
1. 检测系统的微型化，对样品等需要量非常小
2. 同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高
3. 能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系
4. 检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况
5. 节约费用和时间
制作技术
光引导原位合成
原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物，可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和经过修饰的4种碱基，通过光进行活化从而以固相方式合成微点阵。合成前，预先将玻片氨基化，并用光不稳定保护剂将活化的氨基保护起来。聚合用单体分子一端活化另一端受光敏保护剂的保护。选择适当的挡光板使需要聚合的部位透光，不需要发生聚合的位点蔽光。这样，光通过挡光板照射到支持物上，受光部分的氨基解保护，从而与单体分子发生偶联反应。每次反应在成千上万个位点上添加一个特定的碱基。由于发生反应后的部位依然接受保护剂的保护，所以可以通过控制挡光板透光与蔽光图案以及每次参与反应单体分子的种类，就可以实现在特定位点合成大量预定序列寡核苷酸或寡肽的目的。由于照相平板印刷技术每步的合成效率较低（95%），合成30nt的终产率仅为20%，所以该技术只能合成30nt左右长度的寡核苷酸。在此基础上，有人将光引导合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，将每步合成产率提高到99%，但制造工艺复杂程度增加了许多。所以如何简便地提高合成产率是光引导原位合成技 术有待解决的问题。
打印原位合成
压电打印原位合成的方式类似于喷墨打印机，合成原理与传统的核酸或寡肽固相合成技术相同。合成过程为：合成前以与光引导原位合成类似的方式对芯片片基进行预处理，使其带有反应活性基团，例如伯氨基。同时，将合成用前体分子（DNA合成碱基、cDNA和其它分子）放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的碱基合成前体试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。由于脱保护方式为酸去保护，所以每步延伸的合成产率可以高达99%，合成的探针长度可以达到40~50nt。以后每轮偶联反应依据同样的方式将需要连接的分子喷印到预定位点进行后续的偶联反应。类似地重复此操作可以在特定位点按照每个位点预定的序列合成出大量的寡核苷酸探针。
点 样 法
点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上，并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理，例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上。现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。这些自动化仪器依据所配备的“打印”或“喷印”针将生物大分子从多孔板吸出直接“打印”或“喷印”于芯片片基上。“打印”时针头与芯片片基表面发生接触而“喷印”时针头与片基表面保持一定的距离。所以，“打印”仪适宜制作较高密度的微阵列（例如2500点/cm2），“喷印”法由于“喷印”的斑点较大，所以只能形成较低密度的探针阵列，通常400点/cm2。点样法制作芯片的工艺比较简单便于掌握、分析设备易于获取，适宜用户按照自己的需要灵活机动地设计微点阵，用于科研和实践工作。
目前，除了在生物芯片研制方面享有盛誉的Affymetrix公司等个别公司使用原位合成技术制造芯片外，大多中小型公司普遍采用点样技术制作生物芯片。
检测和分析
检测的原理
荧光标记和检测是利用荧光标记的DNA碱基在不同的波长下吸收和发射光。在微阵列分析中，多色荧光标记可以在一个分析中同时对二个或多个生物样品进行多重分析，多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性，排除芯片与芯片间的人为因素。荧光为基础的分析使得利用一些先进的数据获得技术成为可能，包括共聚焦扫描的CCD照相技术。用于芯片制备的无孔基质表面使得芯片检测中的生化反应大大受益。玻璃基质所需的反应体积（5-200ul）比传统的分析要小的多（5-50ml），小反应体积降低了试剂的消耗，增加了微阵列分析中核酸的反应物的浓度（0.1-1um）,相对于传统分析（0.1-4pm）增加100000倍之多，浓度的增加又能加速杂交的速度，从而减少获得强荧光信号的时间，并可用盖玻片封闭杂交槽进行杂交反应。 对于以核酸杂交为原理的检测技术，主要过程为：首先用生物素标记经扩增（也可使用其它放大技术）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）作为显色物质，图象的分析则用落谢荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微装置对片基扫描，由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。由于完全正常的 Watson-Crick配对双链要比具有错配(mismatch)碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性，所以，前者的荧光强度要比后者强出5-35%。从这一点来说，该检测方法是具有一定特异性的，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子含量呈一定的线性关系。
荧光探针
目前用荧光探针作为检测信号的仪器，主要是考虑荧光标记所要检测的DNA的效率，以及荧光探针本身的发光效率和光谱特性。
（一）PCR过程中的DNA标记
1.末端标记：在引物上标记有荧光探针，在DNA扩增过程时，使新形成的DNA链末端带有荧光探针。
2 .随机插入：选择四种缄机基，使其中一种或几种挂有荧光探针，在PCR过程中，带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。由于带有荧光探针的碱基，可能影响PCR的产物，因此，需要调整荧光标记的碱基与未标记的碱基比率，以使得PCR产量和带有荧光探针的碱基在DNA的插入率达到一个平衡的水平，使杂交信号最强。
（二）RNA转录过程的荧光探针标记
某一种碱基标记有荧光，但要求该种碱基标记与非标记按一定比率混合，以达到最佳转录效果。
（三）荧光探针的选择
主要考虑以下几个因素：
荧光探针的激发和发射频谱；
荧光探针的发光效率；
荧光探针对PCR或逆转录效率的影响；
不同荧光探针的发射光谱是否有重叠。
常用的荧光探针：FITC，CY-3，ALEAX488，CY-5，ALEAX564
聚焦扫描和CCD扫描仪
一旦荧光标记样品和微阵列反应后，未结合的成分就可洗去，结合到芯片的样品可通过荧光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描主要是利用玻璃基质小区域（约100um2）的激光发晒透镜（或两者）使整个影像聚集，每个位点上带荧光的样品发射的光通过一系列的反光镜，光片和晶体后与不要的光分开，然后被光电倍增管（或一种类似的装置）转换成一种电信号。聚焦扫描聚焦数据的速度（1-5min）要比传统实验中的放射自显影快的多（1-10天），快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。CCD相机利用许多与聚焦扫描仪相同的原理聚焦荧光影像。
生化反应
杂交反应概述
该过程指将从生物样品分离到的蛋白、DNA或RNA样品与生物芯片进行反应，从固定于芯片的探针阵列得到样品的序列信息。由于玻片本身的荧光本底很低，所以可用荧光标记的方法来对生物芯片实施检测和分析，同时具有快速、精确和安全等优点。而且，还可用多个荧光素进行标记以实现一次性分析多个生物样品。玻片作为支持物还可使反应体积缩小到5-200μl，而通常的杂交反应体积为5-50ml。这样一方面节约了试剂，同时还可以提高反应试剂的有效浓度(0.1-1μM)，是常规检测(0.4-4pM)的一万倍。因此促进了杂交速度减少了杂交时间，并可取得较强的荧光信号。
核酸样品
RNA样品通常需要首先逆转录成cDNA并进行标记后才可进行检测。目前，由于检测灵敏度所限，尚难以普通探针对极少量的核酸分子进行杂交和检测，所以需要对样品或后续测试信号进行适当的放大。多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，例如通过PCR方法，以使样品核酸的拷贝数有所提高达到检测的灵敏度。但用DNA芯片进行检测分析时需要对样品大量的DNA片段进行扩增和标记,所以需要同时对样品核酸分子大量的区域进行扩增，这是一项工作量非常巨大的工作。顺应这一要求出现了许多解决办法，并在不同程度上减轻了工作量。例如，Mosaic Technologies公司引入的固相PCR方法，将多对引物固定于支持物上（其位置和序列信息预定），以类似于原位PCR的方式一次性对样品多个片段进行扩增和放大，而且不会由于引物种类过多而出现相互间的竞争和抑制（这种情况曾出现于多重PCR中）。引物具有较强的特异性，扩增反应也不存在交叉污染，因而省略了处理常规多重和多个PCR反应的繁琐工作。再如，Lynx Therapeutics公司引入的大规模并行克隆（massively parallel solid-phase cloning），可在一个样品中同时对数以万计的DNA片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。
除了检测前对样品分子的放大外，通常仍需要有高灵敏度的检测设备来采集、处理和解析生物信息。但，亦有不经过对样品的扩增和放大而直接应用特殊处理的探针，例如分支探针技术，而达到较高的检测灵敏度水平。这种方法的原理是，设计具有庞大分支结构的分支核苷酸探针，分支末端以酶标记。这样，经过分支核苷酸与酶的双重放大作用而将标本杂交时极弱的信号转换为较强的化学信号。该技术比较成功的例子就是HCV与HBV的检测。它的最大优点在于其操作简便，具有较高的灵敏度，同时也可以保证检测结果的特异性[2]。当然，由于不同检测方式的灵敏度不同对于样品的处理和扩增情况的要求亦有所不同，具体的处理和放大方法仍需根据实际情况进行选择。
蛋白及其它生物样品
同样，基于生物大分子相互作用原理的生物芯片在检测时生物样品的处理遵循相似的方式，即信号的放大和样品的标记。例如，蛋白芯片在进行检测和分析时，可以将待分析的蛋白样品用荧光素或其它物质进行标记，然后与生物芯片上的生物大分子进行相互作用，最后依据标记物质的不同采取相应的检测方式采集和分析样品和芯片上生物大分子相互作用的结果。对与非核酸类的生物大分子，存在的问题是有时不便于对其进行扩增和放大，因为其它生物大分子的结构相对比较复杂不能进行简便的克隆或扩增。所以，这就向检测的灵敏度提出了更高的要求。其它生物大分子的检测和分析类似与蛋白分子。例如核酸与蛋白的相互作用，配体间的相互作用，糖与蛋白的相互作用等。
抗体芯片
蛋白质是一切生命活动的基础，受基因表达的调控，因而以检测样品中的mRNA为基础的cDNA芯片是当今研究中倍受关注的研究手段。但是，由于存在着转录后加工、翻译调控以及翻译后加工等多种调节机制，基因的表达，或者说mRNA的水平并不必然代表蛋白质产物的水平。因此，以微阵列技术对生物样品作整体蛋白质表达分析的蛋白芯片在后基因组时代越来越受重视。抗体芯片（Antibody Microarray，抗体微阵列），是蛋白质芯片的一种，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，将极大促进蛋白质组目前的研究状况——因为以现有的技术中对蛋白质进行这种复杂的分析是非常困难的。
Clontech公司第一代的抗体芯片Ab Microarray 380（Cat.No.K1847-1）包含固定在玻璃片基上的378种已知蛋白质的单克隆抗体，可以在一次简单实验中同时检测样品中的378种蛋白质的表达情况，并且可以在一张芯片上对两种样品的表达模式进行比较分析。这使得抗体芯片在毒性实验、疾病研究和药物开发上有广泛的应用前景。Ab Microarray 380芯片上每个抗体都是并列双点以增加结果的可靠性，抗体针对广泛的胞内蛋白和膜结合蛋白，已知参与信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能，因而可以用于检测某一特定的生理或病理过程相关蛋白的表达模式。尽管抗原来自人，但很多抗体可以识别小鼠或大鼠的样品。详细的资料可以上网查询。
芯片上抗体的选择不但根据其特异性，也根据抗体的结合亲和力，在验证实验中特异性低、交叉反应高、或者信号强度低的抗体都被排除，另外所有抗体都经过检验保证得到的信号与抗原浓度有良好的线性相关，那些没有良好的线性剂量关系的抗体都被排除。因此抗体芯片能够检测到样品中很低的pg/ml浓度的抗原。第一代的蛋白芯片和DNA芯片一样是作为一种定性分析的工具，可用于分析样品之间相关蛋白的相对表达丰度；还可以作为DNA芯片的补充，用于研究蛋白和基因表达之间的关系。
操作流程
抗体芯片并不要求特殊的技能，只要一般常规的操作就可以完成以往极为复杂耗时的工作。整个操作流程包括：从50—200mg组织或细胞、体液中进行蛋白质抽提——用Cy5和Cy3两种不同颜色的荧光分子分别标记两个样品——洗去多余的标记分子——与芯片杂交孵育——扫描分析结果。整个过程从样品制备到结果分析只要一天即可完成，你只要准备好样品、荧光染料、脱盐纯化柱（处理体液样品时用）和荧光扫描仪，其他的试剂全部由试剂盒提供。
优化的试剂
随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液，是专门为抗体芯片而设计的，非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白（相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白）的同时能保持蛋白的天然活性（非变性条件），这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性，保证以后的实验结果的真实性，和原始材料的一致性。
内源标准化信噪比(Internally Normalized Ratio)
根据操作手册进行内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比（INR），内源标准化处理是指对两个样品（A、B）中分别用两种荧光标记分子（Cy3和Cy5）标记，并交叉与芯片杂交（见图，A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交），可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照，也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3，单纯一个实验的结果就会有偏差（Cy5标记的样品信号偏高），用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值，通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值，这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。
抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因，根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。
这是一种通道型的主动式生物芯片，也是目前研究得最多的一类。利用微加工技术和MEMS技术可以在基片上刻蚀出各种微通道或流路以及反应池等，用一定的外力或场驱动样品或反应溶液在其中流动，并制作出微泵、微阀等结构器件以控制液体的流量和方向，将可以实现将生化反应的若干个步骤的集成，从而使生物芯片技术向缩微芯片实验室发展。
但是要将生化分析的全部复杂步骤都集成在一块芯片上并不是一件简单的事。目前问世的都是一些功能较简单或单一的微流路芯片，包括毛细管电泳芯片、PCR反应芯片等。Burns等1998年研制的集成纳升分析芯片融化了多项技术，具有较高智能度和集成度。该装置大小为47mm×5mm×1mm，采用标准光刻蚀和微细加工工艺，在硅基片上构建显微通道及各种复杂装置，在计算机控制下，由芯片外微空气泵驱动栽有反应物、缓冲液及DNA样品的纳升级小液滴——“微射流”在整个芯片上流动。通道中的疏水微区可把小液滴隔开，而埋有聚丙烯基质的区域可进行原位电泳，用裂解液释放细胞中的DNA后，混合物注入反应室，其中的一块玻璃墙靠电荷相互作用，吸附样品中的核酸，经清洗、重溶后流到扩增室，由微加热器提供温度循环进行扩增，然后把DNA转录承RNA并带上荧光标记，送到DNA微阵列进行杂交。
Jacobson等则在进行一种毛细管电层析芯片的研究。他们用光刻蚀技术在玻片上制备5.6μm宽66μm的通道，表面以十八硅烷修饰后做固定相，用电渗流转运流动相。Regnier等用深度活性离子刻蚀法，在石英表面原位刻蚀出单片颗粒状支持结构阵列，以替代常规层析柱中的微粒，移动相通过电渗流在1.5μm宽的通道上转运。
由常规分子微阵列构成的芯片，探针与靶分子被动杂交，反应速率受分子扩散限制，故有学者设想构建微电极阵列，利用电场增强杂交。Sosnowski等采用微电子工艺，在热氧化惰性处理的硅片基上构建了25个半径40μm的Pt-Si3N4电极阵列，并在电极上蚀刻出样品池，其上覆盖带有链霉亲和素的琼脂糖凝胶渗透层。在电场作用下，生物素标记的探针被运转到特定的电极上与目的片段杂交，达到了能检测单碱基错配的分辨率。这种杂交不仅反应速度快，通过改变电场强度还可以控制分子结合的强度。
更重要的是，还可在此类芯片上直接制备杂交样品，克服了常规分子微阵列芯片的制样困难。通过在硅片上制作一系列各种排列的金属电极和在这些电极上施加高频电场就可在不同的细胞内感应出偶极，而偶极的出现又反过来使不同的细胞要么承受正介电力，要么承受负介电力，从而能够使他们从各种不同的液体样品中分离出来。1998年，Nanogen公司研制了采用上述介电电泳原理将大肠杆菌从含有人体血细胞的混合物中分离出来的生物电子芯片，同时此芯片在蛋白酶消化作用下完成对细胞的胞解作用。处理后的大肠杆菌中的DNA或RNA经电寻址导向式杂交在另一块芯片上完成杂交分析。
这类芯片发展迅速。1999年，Gilles等在硅片上蚀刻出电子回路和电极构成芯片，经扩增的病人DNA样品在芯片上转运、浓缩并吸附到特定电极上形成阵列，并与荧光标记的探针杂交，快速精确地区分了人甘露糖结合蛋白质基因中复杂的四等位单核苷酸多态性，并把该方法成为电子点杂交。而最近，一种将微电极阵列、微流路和电泳技术结合起来的三维叠层芯片已经在Nanogen公司问世。它与该公司的另一类电寻址探针阵列芯片连接起来，可构成完整的微型实验室分析系统。
这是以清华大学程京教授为首的我国科学家首创的一类主动式生物芯片。它主要是利用外加磁场的作用，通过改变电磁力来改变芯片中DNA或者蛋白质分子的流向和流速，达到分离的目的。此外这种芯片还有效地将电场和磁场的作用结合在一起，通过计算机可控制芯片上任意一点发生的生化反应，具有分析灵敏度高、样品分析时间大为缩短等特点。其中，可单点选通的电磁阵列技术、电旋转检测技术等均为世界首创。
