免疫组织化学方法是一种把分子水平的物质准确具体表达出来的一种方法，这些分子水平的物质可能与癌细胞，细菌，病毒等等有关。自从成功地制作出这些特异性的抗体，使组织结构可以从分子水平中显示出来，这些特异性抗体可以与肿瘤细胞中特定的结构结合，这些抗体被称为单克隆抗体。把这些单克隆抗体孵育在组织切片上，与特定的靶细胞进行特异的反应。如单克隆抗体可以与癌细胞发生特异性反应，单克隆抗体可以从特定的肿瘤病人血细胞中获得。在组织切片中结合的抗体可以用棕色或红色显示出来。比如，对转移到骨组织中的肿瘤细胞进行标记实验，我们可以用前列腺特异性抗体进行标记，如显示出棕色或红色的阳性反应，我们可以明确地判断这个转移性肿瘤来自前列腺癌，有些转移的肿瘤距原发部位可能更远。免疫组织化学不仅能帮助准确地诊断出肿瘤的性质，还可以预测肿瘤预后的生物学行为。例如，我们可以知道所有组织细胞的增殖活性。这不是更有意义的实验吗？我们能够判定在一种肿瘤组织中，80%的细胞增殖抑制了其他10%的肿瘤细胞的增殖，我们可以判定出这种肿瘤细胞增殖率高，要比其他肿瘤生长迅速，进展快。
在其他方面，免疫组织化学染色可以指导某些肿瘤的化疗，如：可以测定女性乳腺癌细胞中携带雌激素受体的含量。如果癌细胞中雌激素表达阳性，病人可以进行三苯氧胺的治疗，雌激素能够促进乳腺癌细胞的生长，三苯氧胺有封闭癌细胞中雌激素受体的功能。在此过程中，携带雌激素受体的癌细胞是通过激素促进它生长的，而且，癌细胞增生可以通过三苯氧胺治疗来阻止其生长的。因此，免疫组织化学测定雌激素受体的表达情况，可以预测三苯氧胺治疗的意义。这仅仅是免疫组织化学应用中的一个小例子。免疫组织化学在确定组织起源中的应用前景是无限的。免疫组化技术是一个复杂的生物技术，对每一个抗体标记物都有独自特定的染色方法，目的是能够明确各种组织起源，判定组织中是否存在特异抗原。
癌症病人就诊时，外科医生会在肿瘤部位取一小块组织，送给病理科医生。在病理科，送检的组织经过石蜡包埋，制作成非常薄的组织切片，切片再进行HE染色，然后病理科医生将切片放在显微镜下观察，观察送检的标本中有没有肿瘤细胞，并做出诊断是患何种肿瘤。不幸的是，许多肿瘤组织细胞在显微镜下看起来非常相似，以致于病理医生难以完全准确地判断出肿瘤的性质。在许多肿瘤病例中，鉴别诊断是非常困难的，因为只有明确了肿瘤的性质，医生才能针对每种肿瘤制定出最有效的治疗方案，目前已经从分子水平研究出肿瘤细胞的表面和细胞内有特异性的物质表达。过去在传统的光学显微镜下及电镜下所看到的组织切片中的结构，曾经幻想的分子水平的结构，已经有现代免疫组织化学技术证明，这个技术的整个过程就叫做免疫组织化学方法。
CD，即分化丛（clusters of differentiation）。第Ⅳ届国际免疫学会议命名委员会（1983，京都），根据T细胞表面的分化抗原存在丛集现象，将这种抗原命名为CD抗原。CD抗原不仅存在于T细胞，也存在于B细胞，巨噬细胞等。
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1． 抗原特异性。指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2． 共同决定簇。即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3． 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
• 抗原决定簇。它是指在抗原分子上为免疫系统识别和作用的基团，是抗原的关键结构。抗原决定簇的种类有1016?/FONT>1018种之多。决定簇的数目称为决定簇的价数，较大的分子决定簇较多，如红细胞上的A或B血型抗原，其决定簇数目可能超过100万。
• 多抗和单抗特性比较
1. 均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4. 重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。
绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。
被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。
保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
病理科成立免疫组化室需要哪些小设备（仪器）
1． 冰箱（4℃、-18℃）：贮存免疫试剂用。
2． 18cm不锈钢高压锅+电炉或家用微波炉。（抗原修复用）
3． 孵育盒（有机材料）；不锈钢或塑料耐高温切片架。
4． 冲洗瓶两个，定时器一个，10ml玻璃试管五个，塑料试管架。
5． 1000ul国产移液器两支，200ul进口移液器一支，20ul进口移液器一支，相应吸嘴。
6．磨砂玻片。
7. PAP油笔。
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。
一、直接法
1．检查抗原法 这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
2．检查抗体法 将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。
二、间接法
1．检查抗体法（夹心法） 此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。
2．检查抗体法 用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清 ，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上， 再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光 。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。
3．检查抗原法双薄片 此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗全显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。
三、补体法
1．直接检查组织内免疫复合物法 用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物---抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。
2．间接检查组织内抗原法 常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体—抗补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。
四、双重免疫荧光标记法
在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后， 按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
五、对照试验
为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以上对照试验：
1．直接法 需设下述对照试验
（1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光（无与特异性荧光相似的荧光）。
（2）抑制试验：可分为二步法和一步法。
①二步抑制法：标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
②一步抑制法：先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。此法效果较二步法好，并且简便。
（3）阳性对照：用已知阳性标本作直接法免疫荧光染色，结果应呈阳性荧光 。
如对照（1）和（2）无荧光或弱荧光，（3）和待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
2．间接法
（1）自发荧光对照：同上（一）。
（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
（3）抑制试验：同上。
（4）阳性对照：同上。
如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本阳性则为特异性荧光。
3．补体法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1：10稀释先作用标本，再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再用1：10稀释度的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀 释液，结果应为阴性。
（6）阳性对照：（1）～（5）结果阴性，（6）和待检标本阳性时，则为特异性荧光。
1． 诊断敏感性。指患者中因此试验得到阳性结果的百分率。计算方法：TP/（TP+FN）χ100%。理想试验的诊断敏感性为100%。
2． 诊断特异性。指正常人与无关疾病的患者中因此试验得到阴性结果的百分率。非患者的阴性结果为真阴性，其阳性结果为假阳性。计算方法：TN/（TN+FP）χ100%。理想试验的诊断特异性应为100%。
3． 诊断指数。为评价某种试验敏感性与特异性的综合指标。理想的指数应为200%，≤100%的试验不能成立。
4． 诊断效率。某种试验能准确区分患者和非患者的能力。计算方法：（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）×100%。理想试验的诊断效率应为100%。
5． 阳性预测值。指在所有阳性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TP/（TP+FP）×100%。理想试验的阳性预测值应为100%。
6． 阴性预测值。指在所有阴性结果的人中，非患者的百分率，计算方法：TN/（TN+FN）×100%。理想试验的阴性预测值应为100%。
