（一） 原理
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
（二）材料与试剂
1．PBS液 取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即可。
2．DAB溶液 取5mgDAB(3、3二氨基联苯胺)加入10mlTris－HCl缓冲液(0.05mMol/L pH 7.6)，加1%H2O20.5ml～1ml。配制时，避光进行，现用现配。在显色完成冲洗过程中，要保持流水冲洗，防止非特异性物质积于标本上。
3．戊二醛固定液 取50ml 0.2Mol/L PBS缓冲液与25%戊二醛按以下比例配制：
0.2Mol/LPBS液 50 50 50 50 50
25%戊二醛（ml） 4 6 8 10 12
重蒸馏水（ml） 46 44 42 40 28
固定液终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
（三）操作方法
1．酶标抗体的制备 疫酶技术章。
2．取材 将培养细胞或悬浮细胞用0.1Mol/L PBS液冲洗，离心沉淀后，立即转入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性质所定)。如病料为组织块，则取适当大小，先固定1h然后取出，以新的双面刀片切成50～100µm的薄组织再行固定1h～2h。
3．漂洗 以PBS液漂洗过夜，换液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃过夜，孵育的标本放置于加盖的瓷盘内，底层垫数层纱布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脱，造成非特异性吸附。
5．PBS冲洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液冲洗3～4次每次10min。
8．酶标记抗体孵育；用适当稀释的酶标抗体(即工作浓度)于25℃湿盆内孵育1h或4℃过夜。
9．PBS液冲洗3～4次每次10min或4℃漂洗过夜。
10．酶显色处理 将漂洗后的标本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。显色强弱与戊二醛的固定有关。若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11．常规包埋、切片、电镜观察 在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色，切片一般在2µm～4µm，切片后染色不存在通透困难的问题。无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色，最好在光镜下定位选择后，再做电镜定位包埋，这样目的性强，可减少工作量。
（四）结果判定
在已知阳性、阴性样品成立的前提下，凡出现棕色颗粒，即指示抗原抗体的存在，同时可观察到病毒颗粒的存在，判为阳性(＋)，否则判为阴性(－)。
（一） 原理
免疫铁蛋白技术是以铁蛋白标记抗体，再以铁蛋白抗体与待检抗原作用。通过电镜检查，观察到铁蛋白抗体所在的位置，即抗原所在。
（二）材料与试剂
1．马脾铁蛋白
2．硫酸铵
3．硫酸镉
4．双异氰酸镉二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将XC配制成1%溶液。注意配制的水及容器必须特别清洁，配制后放置4℃数天，以不出现沉淀为准。如出现沉淀XC的多聚体形成，应重配。
5．0.30Mol/L pH 9.5硼盐酸缓冲液
6．0.1Mol/L硫酸铵液
7．0.05Mol/L pH 7.4 PBS液
（三）操作方法
1．铁蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸铵液，并以1Mol/L的NaOH或HCl调pH值，正好为5.85。取1g铁蛋白溶于100ml的2%硫酸铵液中。
⑵ 加入20%硫酸镉，使最终浓度为5%，混匀，4℃过夜。
⑶ 1 500g离心(4℃)2h，去上清。仍加2%硫酸铵至100ml，混匀，离心，去除不纯沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸镉，重复步骤⑵，离心，去上清。
⑸ 检查沉渣，置显微镜下检查，应具有典型的黄褐色结晶，结晶为六角形，双一四点结构，如结晶不典型，应继续重复以上步骤。
⑹ 以少量的蒸馏水溶解，再加50%饱和硫酸铵溶液，使之沉淀，离心，去上清。
⑺ 重复步骤⑹一次。
⑻ 以少量蒸馏水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
⑼ 100 000r/min离心2h，去除上部无色上清液(约3/4总量)，置4℃过夜。
⑽ 用微孔滤膜(孔径0.45μ)过滤，使铁蛋白含量为65mg/ml～75mg/ml，分装，4℃保存不要冻干保存,以免铁蛋白结构遭破坏。
2．铁蛋白－抗体交联法
⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将铁蛋白稀释成20mg/ml～25mg/ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室温搅拌45min，离心去沉淀。
⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸盐缓冲液将提纯lgG配成5mg/ml，以1︰4的比例(V/V)加入IgG与铁蛋白－XC液，4℃搅拌48h。
⑷ 以0.1Mol/L碳酸铵溶液透析过夜，以除去多余的异氰酸盐，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢复到生理水平。
⑸ 超速离心 以1.00×105g离心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS悬浮，再次离心，以除去未结合的IgG。
⑹ 以血清学及免疫学方法测定结合抗体的特异性、免疫活性以及标记效应，如果操作步骤严格，结果是满意的。
3．铁蛋白－抗体结合物处理标本
（1）将标本以5%福尔马林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min～60min。
（2）用冷的PBS液洗涤，离心。
（3）如是组织块，则在解剖显微镜下切成更小块，放入试管中，加入铁蛋白－抗体结合物置室温20min，不时振荡,
（4）以冷PBS液洗涤三次，离心。
（5）沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗涤。
（6）再以锇酸固定，脱水包埋。
也可以先超薄切片，再进行铁蛋白－抗体结合物染色。操作如下：
⑴ 将培养细胞以1%福尔马林PBS液固定(4℃)。
⑵ PBS液洗涤离心。
⑶ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液悬浮置入胶透析膜袋中，再将袋置于吸水剂粉末上，待牛血清白蛋白成胶状物时，将透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。
⑷ 取出，切成小块，以PBS液洗涤。
⑸ 置干燥器中以硅胶干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于经4%牛血清白蛋白PBS液处理的披有胶膜的载网上(牛血清白蛋白的处理在于减少铁蛋白结合物非特异性吸附于载网上)。
⑺ 滴一滴铁蛋白－抗体结合物于载网上。
⑻ 5min后，浮网于PBS液面,标本面向下，以除去多余的结合物。
⑼ 凉干后，滴一滴乙酸双氧铀或氢氧化铅以复染。
⑽ 水洗、晾干、电镜观察。
（四）结果判定
在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。
（一） 原理
标记抗体法虽然具有许多优点，但也存在一些难以克服的问题，如标记抗体的分子增大，对细胞膜和组织的穿透力减弱；化学交联反应对抗体和酶的活性有所影响；结合物中未标记的抗体可与抗原竞争结合，影响检测方法的敏感性等。不标记抗体法可以避免上述的不利影响因素，通过一系统的非标记抗体的免疫学反应，对组织中的抗原进行定位检测。不标记抗体法又可分为用标记物显示和不同标记物显示两种方法。前者利用基因工程方法制备双特异性抗体的F(ab′)2，一个Fab片段与标本中的抗原结合，一个Fab是抗体蛋白的结合片段。在抗体与标本作用后，再加入铁蛋白与抗体结合，从而显示组织内抗原的所在部位。后者则用磷酸钨负染后，直接电镜观察。
（二）材料及试剂
1．待检病毒材料 如粪便，气管分泌物、脑脊髓液、组织培养液等。
2．高速离心机
3．已知抗体
4．磷钨酸
5．琼脂糖
6．其它
（三）操作方法
1．经典法
（1）将被检病毒材料0.9ml，加1︰5～1︰10稀释的特异性免疫血清0.1ml充分混合。
（2）置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃过夜。
（3）以17 000r/min～23 000r/min离心90min。
（4）吸去上清，将离心管口倒置于滤纸上，吸去残留液体。
（5）沉淀物中加少量H2O混悬，用3%磷钨酸(pH6.0)负染20Sec～30Sec，滴加于400目铜网Fomnvar膜上，用滤纸从铜网边缘轻轻吸去多余的负染液。
（6）在透射电镜下4×104倍观察。
2．快速法(琼脂扩散法)
（1）同经典法(1)、(2)步骤，制备免疫复合物。
（2）以生理盐水或pH 7.2巴比妥缓冲液制备1%琼脂糖，趁热浇注于洁净的载玻片上，每片3ml，待冷却凝固后，在凝胶面上等距离放置直径4mm玻璃珠数粒，再于凝胶面上浇注1%琼脂糖2ml～3ml，冷却凝固后，取出玻璃珠，使凝胶形成凹孔。
（3）将普通滤纸剪成2×3cm大小，3～4层重叠。用小刀将带有凹孔的琼脂糖切成小块,每块带有一个凹孔,平放在滤纸上。
（4）在凹孔内，加入制备好的含病毒的免疫复合物悬液。
（5）将电镜载网的Fomnvar膜面向下倒悬于液滴上。由于琼脂糖的吸水作用，20min～30min后，可将液滴的水分吸干，而浓缩的免疫复合物则粘附在载网膜上。
（6）在载网膜上滴加3%磷钨酸负染20Sec，过量的负染液用滤纸在载网边缘轻轻吸去。
（7）于透射电镜4×104倍下观察。
（四）结果判定
直接观察病毒粒子的形态。由于离心浓缩的处理和特异性抗体的加入，大大提高了观察的敏感性。
