*无扩增条带
常见问题 可能原因 建议解决方案
模板 模板中含有杂蛋白、Taq酶抑制剂等 纯化DNA模板，去除蛋白杂质或使用试剂盒提取模板DNA
模板核酸变性不彻底 适当提高变性温度，延长变性时间。
模板降解 重新制备模板。
引物 引物合成质量不佳 重新合成引物。
引物降解 高浓度小量分装保存，防止多次冻融，避免长期置于冰箱冷藏部分。
引物设计不合理（如引物长度不够，引物之间形成二聚体等） 重新设计引物（避免形成引物二聚体和二级结构）。
Mg2+浓度 Mg2+浓度偏低 适当提高Mg2+浓度：从1 mM到达3mM，间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度.
退火温度 退火温度过高,影响引物与模板的结合 降低火温度。
延伸时间 延伸时间短 增加延伸时间。
*假阳性
现象：阴性样品出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致
常见问题 可能原因 建议解决方案
PCR污染 靶序列或扩增产物的交叉污染 操作时应小心轻柔，防止将含靶序列的样品吸入加样枪内或溅出离心管外；试剂或器材应高压灭菌，破坏存在的核酸。
试剂污染 各种试剂先进行分装，并低温贮存。
引物 引物设计不合适，选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性 重新设计引物。
*出现非特异性扩增
现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者有时同时出现特异性扩增带与非特异性扩增
常见问题 可能原因 建议解决方案
引物 引物特异性差 重新设计引物。
引物浓度过高 适当减少引物浓度。
Mg2+浓度 Mg2+浓度过高 适当降低Mg2+浓度，从1 mM到3 mM，间隔0.5 mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物最佳镁离子浓度.
耐热聚合酶 酶量过多 以0.5U为间隔适当减少酶量.
退火温度 退火温度过低 适当提高退火温度或采用二阶段温度法.
PCR循环次数 PCR循环次数过多 减少PCR循环次数.
*出现片状拖带或涂抹带
常见问题 可能原因 建议解决方案
引物 特异性差 重新设计引物,改变引物的位置和长度,增强基特异性.
模板DNA 模板不纯 纯化模板或使用试剂盒提取DNA.
耐热聚合酶 酶量过多 以0.5U为间隔适当减少酶量.
Mg2+浓度 Mg2+浓度过高 适当降低Mg2+浓度,从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度.
dNTP dNTP浓度过高 适当降低dNTP浓度.
退火温度 退火温度过低 适当提高退火温度
*50μl PCR反应体系中模板DNA的加入量?
人基因组DNA 0.1～1μg
大肠杆菌基组DNA 10～100ng
λDNA 0.5～5ng
质粒DNA 0.1～10ng
*如何进行长片段的扩增?
首先需选择正确的耐热聚合酶。 Long Taq DNA Polymerase是具有3′-5′外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶，扩增效率高并且错配率低，对简单模板可扩增长达1 kb的片段，对复杂二级结构（GC rich等）和具有重复序列的模板可良好扩增长达15 kb的片段。此外，较长产物的扩增还需要相应调整引物设计、延伸时间、变性时间和缓冲液pH等。引物使用标准方法设计，通常18～24mers会得到较好的产量。按1kb/分钟的速率增加延伸时间使DNA聚合酶完成聚合反应。为了保证有效的长片段扩增，可以将延伸温度设置为68℃左右。同时为防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，扩增前升温至94℃的时间应低于1分钟。
*如何提高PCR扩增的保真性？
下游应用为基因筛选、测序、突变检测和分子诊断的用户，对PCR保真性要求很高。降低PCR扩增的错误率可以通过使用各种具有高保真性的DNA聚合酶来实现。DNA聚合酶的保真度用错误率来表示，包括碱基错配率、PCR产物突变百分数等。在目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中，Pfu酶的出错率最低，保真度最高（见附表）。除对酶进行选择，研究者也可通过优化反应条件来进一步减少PCR突变率，包括优化缓冲液组成、耐热聚合酶的浓度及对PCR循环条件进行优化等。
附表：DNA聚合酶的扩增错误率
耐热DNA聚合酶 碱基错配率 *PCR产物突变百分数（%）
Pfu DNA Polymerase 1.3×10-6 2.6
Taq DNA Polymerase 8.0×10-6 16.0
VentR DNA Polymerase 2.8×10-6 5.6
Deep VentR DNA Polymerase 2.7×10-6 5.4
Tfl DNA Polymerase 8.3×10-6 16.6
Tbr DNA Polymerase 9.5×10-6 19.0
UITmaTM DNA Polymerase 55.3×10-6 110.6
*应用/acl分析，通过对/acl目标基因进行扩增和克隆，检测PCR产物突变百分数，从而测定DNA聚合酶的错误率。
出现的问题 可能的原因 建议解决方法
核酸产量低或者纯度不高 试剂盒储存非最佳温度 存放在室温（15℃－20℃）
洗脱液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下 每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发,pH改变和污染。
漂洗液W中忘记加无水乙醇 第一次实验时，在漂洗液W中加入指定量无水乙醇。
试剂没有和PCR凝胶溶液或其他要纯化的溶液充分混匀 加入每个试剂后都要充分混匀
洗脱后回收率低 使用了非最佳的洗脱液，洗脱液的高pH非常重要 不要用水洗脱，用试剂盒带的洗脱液EB.
回收后DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 忘记做空离心，乙醇抑制了酶切反应 不要省去步骤8空离心，在空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应 将洗脱的回收DNA溶液13，000rpm再离心一分钟，小心取上清使用，
纯化的DNA产物OD260数值异常偏高
一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数 将洗脱的回收DNA溶液13，000rpm再离心一分钟，小心取上清使用，
洗脱液中不含DNA 在初始处理材料中没有PCR产物 开始回收前，用琼脂糖凝胶/EB电泳检测PCR产物。
回收后DNA的浓度太低 起始的处理材料中DNA含量太低 加大处理量和减少洗脱液的体积，但注意不要少于30μl。
回收的片段小于100bp或者大于10Kb 片段小于100bp或者大于10bp回收效率都会迅速降低，可尝试提高起始处理量。
回收产量不高 使用的溶胶/结合液的量不足 确保PCR产物体积和溶胶/结合液的比例是1:3
PCR覆盖的油，蜡，上样液的颜料并不影响回收过程。
洗脱不完全 可使用2次洗脱缓冲液EB洗脱（每次30μl），合并两次洗脱液。
常见问题 可能原因 建议解决方案
柱子堵塞 裂解或匀浆处理不彻底 减少样品使用量，增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间。
处理样品太多 减少样品使用量
得率低 裂解或匀浆处理彻底 减少样品使用量，增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间。
处理样品太多 请参考最大处理量。
RNA仍在柱上未洗出 加入RNase Free水后，放置几分钟再离心。
洗出液中含有乙醇 漂洗后应再次离心，尽量去除漂洗液。
未除净细胞培养液 收集细胞时，请注意尽量去除培养液。
OD260/OD280比值低 洗胶时使用RNase Free水 使用10mM Tris HCl，pH8.5作为洗脱液。
RNA降解 提取的材料不新鲜 新鲜组织取得后应立即至于液氮中，以保证提取效果。
处理样品量过大 减少样品使用量。
污染了RNase 虽然试剂盒中提供的缓冲液都不含RNase，但使用过程中很容易污染RNase，应小心操作。
DNA污染 处理样品量过大 减少样品使用量。
有些样品本身DNA含量较高，可使用DNase处理 得到的RNA溶液可加入DNase处理，处理后可直接用于后续实验，也可用本试剂盒再进行一次纯化。
DNA产物纯化常见问题分析
常见问题 可能原因 建议解决方案
回收率低或为零 漂洗缓冲液中没加入乙醇 在使用前应确保乙醇已加入漂洗液PW中。
吸附材料上有乙醇残留 洗脱时硅胶膜树脂上有漂洗缓冲液裂留，因含乙醇会降低洗脱效率。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5～10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。
洗脱缓冲液pH值偏低 DNA只在低盐buffer中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10mM Tris-HCl，pH8.5）或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。
洗脱液加入位置不对 洗脱液应加在硅胶膜中心部位，以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面，达到最大洗脱效率。
DNA质量不好 洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜或硅胶树脂上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5～10分钟，彻底去除漂洗缓冲液。
问题 原因 解决方案
DNA带模糊 DNA降解 避免核酸酶污染
电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。
所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应<15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
DNA上样量过多 减少凝胶中DNA上样量
DNA样含盐过高 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
有蛋白污染 电泳前酚抽提去除蛋白
DNA变性 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA
不规则DNA带迁移 对于λ Hind III片段cos位点复性 电泳前于65℃加热DNA5分钟,然后在冰上冷却5分钟.
电泳条件不合适 电泳电压不超过20V/cm；温度<30℃；经常更换电泳缓冲液
DNA变性 以20 mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热
带弱或无DNA带 DNA的上样量不够 增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏席稍高，上样量可适当降低。
DNA降解 避免核酸酶污染
DNA走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
对于EB染色的DNA，所用光源合适 应用短波长（254nm）的紫外光源
DNA带缺失 小DNA带走出凝胶 缩短电泳时间，降低电压，加大凝胶浓度
分子大小相近的DNA带不易分辨 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
DNA变性 电泳前请勿高温加热DNA链，以20 mM NaCl Buffer稀释DNA。
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适 在脉冲凝胶电泳上分析。
DNA产物回收试剂盒常见问题分析
出现的问题 可能的原因 建议解决方法
核酸产量低或者纯度不高 试剂盒储存非最佳温度 存放在室温（15℃－20℃）
洗脱液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下 每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发,pH改变和污染。
纯化结合液BD、漂洗液W中忘记加无水乙醇 第一次实验时，在纯化结合液BD、漂洗液W中加入指定量无水乙醇。
试剂没有和PCR样品及其他要纯化的溶液充分混匀 加入每个试剂后都要充分混匀
洗脱后回收率低 使用了非最佳的洗脱液，洗脱液的高pH非常重要 不要用水洗脱，用试剂盒带的洗脱液EB.
回收后DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全 忘记做空离心，乙醇抑制了酶切反应 不要省去空离心，在空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应 将洗脱的回收DNA溶液13，000rpm再离心一分钟，小心取上清使用，
纯化的DNA产物OD260数值异常偏高 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数 将洗脱的回收DNA溶液13，000rpm再离心一分钟，小心取上清使用，
洗脱液中不含DNA 在初始处理材料中没有PCR产物 开始回收前，用琼脂糖凝胶/EB电泳检测PCR产物。
回收后DNA的浓度太低 起始的处理材料中DNA含量太低 加大处理量和减少洗脱液的体积，但注意不要少于30μl。
回收的片段小于100bp或者大于10Kb 片段小于100bp或者大于10bp回收效率都会迅速降低，可尝试提高起始处理量。
回收产量不高 使用的结合液的量不足 确保PCR产物体积和结合液的比例是1:3
PCR覆盖的油，蜡，上样液的颜料并不影响回收过程。
洗脱不完全 可使用2次洗脱缓冲液EB洗脱（每次30μl），合并两次洗脱液。
常见问题 可能原因 建议解决方案
未提出质粒或质粒得率较低
大肠杆菌老化 请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
质粒拷贝数低 由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。
菌体中无质粒 有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
碱裂解不充分 使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质料质量。
溶液使用不当 溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
吸附柱过载 不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或者×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
质粒未全部溶解 洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
洗脱液加入位置不正确 洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
洗脱液不合适 DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB（10 mM Tris•Cl， pH8.5）或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0～8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
洗脱体积太小 洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
裂解时间过长 加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
洗脱时间过短 洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。
质粒纯度不高 混有蛋白 不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。
混有RNA RNase A处理不彻底 减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。
混有基因组DNA 加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能反基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16小时。
P3溶液加入时间过长 P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
含大量核酸酶的宿主菌 有些宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5 α和Top10。
乙醇残留 漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
质粒的二聚体和多聚体形式 是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。
1、 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3、 电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。
4、 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。
