RNAi技术是利用RNAi为原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。RNA干扰有很多方法：①化学合成法：应用最广泛但成本昂贵，体外合成的长21nt、3`端带有2个游离核苷酸的siRNA较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRNA的效果。② siRNA表达载体：在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNA，或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siRNA。③dsRNA表达载体：多用于果蝇、线虫等低等生物，在体内表达后被Dicer切割成21-23nt的siRNA；或在体外利用Dicer、RNaseIII切割dsRNA产生siRNA，纯化后使用。
低等生物对dsRNA或siRNA导入的条件要求较低，成功率较高，但对较高级的哺乳动物和人类细胞株的转染成功率却不理想。哺乳动物的细胞对dsRNA的导入具有抗拒性，并且值得注意的是大于30bp 的dsRNA导入哺乳动物细胞可诱导干扰素的合成结果是非特异性的和全面的抑制基因表达，最终导致细胞凋亡；同时dsRNA具有浓度依赖性，dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强，但是浓度过高RNAi效应也会降低等。RNAi在哺乳动物中的实验遇到的另一问题是RNAi衰减现象，siRNA被导入细胞后RNAi效应仅持续数天便逐渐消失。此外RNAi技术和反义RNA技术一样，有一些如寡聚核酸合成困难、易被降解、导入困难等相似的缺点。
(1)dsRNA序列的选择dsRNA主要选自已知的cDNA的开放阅读框架(ORF)中的基因区域。为防止mRNA调控蛋白对RISC与靶RNA结合的干扰，应避免选择包括:1)起始密码子下游或终止密码的50～100核苷酸位置以内的区域；2)5′或3′端的非翻译区域；3)内含子区域。此外，序列选择时也应避开多聚鸟苷酸序列区(≥3个)，因为这样容易形成四聚体结构，抑制RNAi作用。选择与靶mRNA上序列互补的21～23个核苷酸长度的片段，以AA开头为佳，因为此法能简化dsRNA合成过程，降低成本，而且合成的dsRNA能更好地抵抗RNA酶的降解。另外，尽量使dsRNA序列中的GC含量接近50%(45%～55%最佳)，高GC含量能明显降低基因沉默的效应。选择前可以搜索BLAST数据库，保证无其他与靶基因同源的基因存在，避免引起对其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA均对RNAi敏感。为确保靶基因表达的有效抑制，最好同时合成两个或以上的针对同一基因的不同靶区域的dsRNA；而且，标记dsRNA正义链的3′端对RNAi现象并没有影响，现有的实验尚未发现mRNA的二级结构对RNAi有任何显著的影响。目前，RNAi技术主要以哺乳动物细胞为对象研究其基因的功能。但>30bp的dsRNA在哺乳动物细胞中会引起干扰素样效应，导致非特异性反应。因而直接选用其下游的产物分子siRNA来代替，达到基因研究的目的。
(2)dsRNA的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。简单生物，如单细胞生物等，可选用电穿孔的方法；较复杂生物可选用dsRNA微注射入生殖细胞或早期胚胎，线虫也能采用肠道或假体腔注射的方法，与微注射相比，RNAi效率上并无显著差别。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等。若使用的是化学法人工合成的siRNA(正义链和反义链)，还要经过退火过程，以双链的形式导入靶细胞。有人提出了以质粒或病毒为载体，通过转导或转染途径，在细胞内以DNA为模板，利用RNA聚合酶Ⅲ，转录为siRNA(直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构)，也能产生较明显的RNAi效应。最近，又有一种新的导入方法，就是借助高压水枪的外力将构建的质粒直接自小鼠的尾静脉注入体内，观察RNAi在活体生物模型而不是培养细胞上的基因沉默效应，但观察到的siRNA的半衰期较短，而且由于使用了高压的外力，过程较复杂，限制了其在人类疾病治疗方面的应用。而Pachuk等则提出了肌注的方法，将针对IL－12的siRNA的质粒表达载体导入小鼠体内，得到的RNAi效应更持久。
(3)发夹样结构的siRNA实验证明，发夹样siRNA能延长在细胞内的作用时间。此类结构可由具有回文序列的核苷酸链形成。但通常回文结构不易获得，也可用头碰头的对称序列来代替。转录发夹样siRNA的模板必须与载体转录启动子紧密相连，而且尽可能有最短的多聚腺苷酸尾巴，这样才能诱导高效的RNAi效应。Paddison等提出类似的结构也可应用于长片段dsRNA(500bp左右)，而不会引起RNA非特异性的降解。这为检测哺乳动物细胞中经过长期发育后的基因功能提供了新的途径。
一、靶siRNA序列选择
靶siRNAA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳动物细胞RNAi实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。
1. siRNA设计的原则
SiRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密码上游d0—100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3’端相邻19个核苷酸作为候选si.RNA靶位点。其中AA（N19）TT是最理想的序列，若靶mRNA中无此序列，亦可选用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成时，siRNA的正义链3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建议设计的siRNA不要针对mRNA的5’和3’端非编码区，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP（siRNA protein complex，核酸内切酶复合物）结合mRNA，从而影响siRNA干扰的效果。最后还应将候选siRNA序列在GenBank进行BLAST检索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。
2. 高效siRNA的序列结构特征
除了靶序列位点的选择，siIRNA序列本身结构特征亦会影响到RNAi效率。RNAi实质上可视为一个RNA与蛋白质互作过程，包括siRNA与RISC结合、RISC的激活以及RISC与靶mRNA的结合和切割，这种互作效应的存在，往往造成siRNA链的选择具有偏爱性。Reynolds等通过对2个基因的180条siRNA序列分析，归纳出以下8个与
siRNA高效性相关的特征:G/C含量低(30%-52%)，正义链3’端具较低稳定性（有利于siRNA与RISC的结合和解链），无反向重复序列（有利于减小siRNA的有效作用浓度，提高siRNA干扰效率），正义链碱基的偏爱性A19（正义链中第19位碱基为A，如下表示类同）；A3；U10；无G/C(正义链中第19位碱基不为G或C)；无G13。依此规则，Reynolds等设计的30条siRNA中有29条是有效的。Kumiko等亦认为siRNA反义链5’端为A/U（即有义链U/A）19和最后7个碱基中有5个A/U，会有助于RNAi的高效发挥，且正义链G/C1和序列中无连续9nt以上的GC重复片段与基因沉默效率呈显著相关。有趣的是，该实验还表明这些规则同样适用于DNA介导的RNAi（DNA-based RNAi.）实验。此外，Amarzguioui等发现正义链5’与3’端的前3个碱基中A/U含量不对称(3’端含量应高一些)和A6对siRNA 的活性亦影响很大。根据上述结果，可以初步绘制出一个高效siRNA序列结构的精细与简略示意图。
现已知道siRNA的反义链决定着靶位点识别，那么在不影响siRNA作用功效的前提下，是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢？Amarzguioui等研究siRNA不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性，认为siRNA的5’端相对于3’端具有对突变的较高耐受性。有学者认为正义链3’突出端的任何碱基修饰对siRNA作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链3’端发生1—4个碱基的错配反而有助于增强RNAI的活性。
二、siRNA制备方法
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括
化学合成
体外转录
长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
三、siRNA的转染
将siRNA、siRNA表达载体或SECs导入哺乳动物细胞中是诱导RNAI发生的关键。有许多转染试剂可供选用，最常用的是脂质体转染试剂。某些情况下电穿孔法亦可用，但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细胞系，使用不同的转染试剂或方法，其效率往往会有所不同；而对于不同的细胞系，使用同一种转染试剂或方法，效果亦会不同。因此在实验过程中，有必要尝试多种试剂或方法来确定最优条件。转染效率可通过测定细胞的密度，转染的时间和siRNA与转染试剂的比例来评价。
四、实验对照设置
实验对照是衡量RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的siRNA转染效率及其最终干扰效果，来确定合适的转染条件和最低有效的SIRNA浓度。有实验表明RISC复合物具有饱和性，且过多siRNA会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc, β—acion等）是较好的阳性对照，针对这些基因的高效SIRNA序列已有报道。阴性对照是用来检测RNAi的特异性。通常作为阴性对照的siRNA与选中的siRNA序列有相同碱基组成，但与靶mRNA无明显同源性。阴性对照的siRNA序列设计有2种方法，一是将特异性siRNA的序列打乱，即“零乱”siRNA（scrambled siRNA），再对其进行BLAST比对，防止与目的靶细胞中的其他基因有同源性；另一种是在特异性siRNA中引入几个错配碱基。若引入的是一个碱基错配，应需考虑它与突变mRNA(即SNP位点)结合能力，最好在设计siRNA时就避免SNP区。
五、RNAi效果检测
RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化。在mRNA水平上，Northern Blot和实时定量PCR是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时，cDNA合成要用oligo(dT)，而不是随机引物，且预扩增片段最好位于靶mRNA序列中siRNA位点的上游。蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。RNAi一般在转染后24小时内发生，其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protein)、siRNA在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。
