一、原代细胞培养原理

原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。

• 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养
• 掌握无菌操作技术
• 了解小鼠解剖操作技术
• 了解原代细胞培养的一般方法与步骤
• 了解培养细胞的消化分散
• 了解倒置显微镜的使用

二、实验材料

• 实验动物：孕鼠或新生小鼠
• 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清）
0.25%胰蛋白酶
平衡盐溶液
70%乙醇
•  器材：灭菌镊子、剪刀若干把
灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个
吸管若干支
酒精灯
原代细胞培养方法

三、胰酶消化法

（1）胰酶消化法操作步骤——取材

a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。

d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。

e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。

f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

（2）胰酶消化法操作步骤——切割

a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。

b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。

c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

（3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。

e. 将细胞调整到5×10⁵/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

（4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次。

b.静置，吸去上清，用平衡盐溶液漂洗消化后的组织块，用吸管反复吹打组织块，使细胞分离，静置，使未分散的组织块下沉。

c. 取细胞悬液接种至加了细胞生长液的培养瓶中（调整细胞浓度到5×10⁵/ml左右），37℃下培养。

（注意：省略了离心、计数等步骤）