酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

众所周知，人或动物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵袭，也有一些疾病可以通过机体自身调控而自愈，这是因为机体内部存在一个免疫系统。免疫系统是由中枢免疫组织（骨髓、胸腺、消化系统免疫组织）和外周淋巴组织（淋巴结和脾脏）的免疫活性细胞（B淋巴细胞、浆细胞），以及由它们产生的多种淋巴因子和抗体所组成。免疫系统对外来物质产生一系列反应的过程称为免疫，而这种反应本身则称为免疫应答。能够在机体中引起特异性免疫应答的物质称为抗原，免疫应答的结果则是刺激机体产生与抗原相对应的特异性抗体和引起细胞免疫。
由于免疫应答同时取决于机体，而不仅是进入机体的物质，所以抗原的定义是相对的。由此，按照免疫应答的效果可以将抗原分为完全抗原和半抗原：完全抗原是指能够直接诱导机体产生特异性免疫应答的一类物质。完全抗原的分子量都大于5000，其化学成分多为蛋白质或脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖体，多肽，核酸等也都是完全抗原。半抗原能与抗体特异性结合，但不能激发机体产生抗体，必须与蛋白质（载体）结合后进入机体，才能产生有效的免疫应答。大分子的半抗原在体外能与对应的抗体结合发生可见反应（凝集、沉淀），小分子的半抗原能与对应抗体结合而不出现可见反应。此外，抗原还可以按照自身的物质属性分为可溶性（毒素、异种蛋白）或颗粒性（细菌、细胞）抗原，或按临床意义分为外源性和内源性抗原。
抗体是在抗原刺激下机体免疫应答的产物。所有抗体都具有与抗原特异性结合的能力。抗体的化学本质是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不过只有当免疫球蛋白针对已知抗原时，才能够称这种免疫球蛋白为抗体。免疫球蛋白属于结构牢固的分子物质，可以经受较大变化的环境作用，诸如56℃加温，在室温下较长时期的贮藏，短期高或低pH处理，甚至与去污剂或尿素接触后仍保持其抗体活性。
抗体活性是指与抗原特异性结合的能力，即二者之间的特殊亲合力。两者非共价键结合，结合的力包括氢键，静电力，范德华力和疏水结合力。抗体抗原之间的反应是可逆的，在适宜的条件下仍可解离而性质不变。
机体内约有1亿种不同的B淋巴细胞，每个独立的B淋巴细胞只能接受一种抗原的刺激从而形成分泌一种抗体的能力，因此特异性是免疫应答的特有标志。如常识所见，麻疹患者愈后即获得对麻疹的终生免疫，而这并不形成对天花的免疫。抗体抗原特异性结合的本质是抗原决定簇与抗体结合簇的专一适配性，抗原决定簇是指抗原分子上专有的化学基因，可以决定其刺激机体所产生抗体的特异性。抗原决定簇与其相对应的抗体结合簇立体构型完全相适应。一个抗原分子可带有多个不同的决定簇。抗原分子量愈大，决定簇数量愈多。决定簇数目代表抗原分子的价。抗体结合簇是在抗体分子上与对应的抗原决定簇发生特异性结合的部位，位于Ig分子的抗原结合分段（V段）上，由重链和轻链的一部分可变区构成。其特异性由氨基酸排列顺序决定，约包括5～15个氨基酸。每个单体免疫球蛋白分子如IgG有2个结合簇，IgA是二聚体，有4个结合簇，IgM是五聚体所以有10个结合簇。(但是，事情并不是绝对的。一种抗体除与相对应的抗原发生特异性反应外，也有可能与化学结构部分相似的其它抗原发生反应，这就是通常所说的交叉反应。交叉反应可能由于两种抗原有共同的决定簇，或由于两者的抗原决定簇虽然不完全相同，但在立体化学结构上密切相关，导致一种抗原能与另一种抗原的对应抗体结合。)
正常情况下，抗体与抗原在机体内结合后，可以被吞噬、排泄而将抗原清除。如果这种抗原属于外源性致病抗原（细菌、病毒、毒素），可以由此达到杀灭或削弱抗原危害的目的。对于内源性抗原，如已经衰退、损伤或突变的异常细胞，也能被及时排除，实现机体自身的免疫调控。当然，在异常情况下，抗体抗原结合后形成的免疫复合物将损伤组织、细胞，引起花粉过敏一类的变态反应或免疫性疾病等不良后果。
不过长期以来所谓特异性免疫血清抗体，不论是从人还是从动物获得的，也不论是主动获得还是被动获得的，实际上都是有许多种具有不同特性的抗体所组成的混合抗体。这是因为，进入机体的抗原往往带有若干个抗原决定簇。此外，不同个体对同一抗原决定簇的反应并不相同，即使同一个体不同时间接受抗原刺激后产生的反应也不完全一致。由于人们无法将体内已受抗原刺激的各种不同的B淋巴细胞克隆区分开，即使在体外能将它们分成单细胞，也无法让其继续生长，增殖并分泌抗体。因此，用常规免疫方法制备的免疫血清抗体只能是数目众多的单克隆抗体的混合物，现在，一般称其为多克隆抗体（PcAb）。这种多克隆抗体存在特异性差、效价低、数量有限、动物间个体差异大，难以重复制备等固有缺陷，许多场合下使用时难尽人意。
1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室的Kohler和Milstein合作发表了题为“分泌预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”的著名论文（Nature,256:495,1975）。他们将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体，通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系，由此单克隆系就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体（McAb）。上述方法创立了一项具有划时代意义的新技术－利用B淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体。这一技术的创立和迅速推广，为所有需要制备和使用抗体的研究领域提供了全新的手段和制剂，促进了生命科学诸学科的发展。两位科学家也由于这一杰出贡献荣获1984年诺贝尔医学和生理学奖。
黄曲霉毒素B1是一种二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，分子量为312，属于半抗原，不能直接诱导机体产生免疫应答。因此我们的工作首先是将黄曲霉毒素B1与载体蛋白连接，合成为完全抗原，以后的研究则基本上采用了前述杂交瘤－单克隆抗体技术的经典方法：动物免疫→免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合→细胞筛选→用有限稀释法分离出可分泌特异性抗体的单个细胞，再经过克隆化培养建立杂交瘤细胞株并制备出大量单克隆抗体，从而在此基础上最终建立了黄曲霉毒素B1（AFB1）的免疫检测方法。

　　凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
　　由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。
　　HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
　　　　　　　　　　　　　　　HRP
　　　　　　　　　DH2＋H2O2────→D＋2H2O
　　供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H２O２已消耗殆尽）。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。

　　酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。
 戊二醛二步法
　　1.　原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
　　2.　标记步骤：
　　(1)　称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
　　(2)　反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。
　　(3)　将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
　　(4)　用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。
　　(5)　加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。
　　(6)　在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
　　(7)　3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
　　(8)　将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
　　3.　结果判定：
　　(1)　定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。
　　(2)　定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。
　　酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
　　IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
　　　　　　　　　酶量(mg／ml)　　 IgG量(mg／ml) 　　酶量
　　克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
　　　　　　　　　　40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量
　　　(3)　本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶与蛋白质结合。
　　4.　试剂及器材：
　　(1)　0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
　　(2)　1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
　　(3)　1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
　　(4)　0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
　　(5)　0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
　　(6)　PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
　　(7)　萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
　　(8)　纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
　　(9)　HRP(RZ>3.0)。
　　(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
　　(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。
　　(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
　

　　本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。
　　1.　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
　　2.　标记步骤:
　　(1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
　　(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。
　　(3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
　　(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。
　　(5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。
　　(6)　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。
　　其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
　　3.　结果判定：
　　除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
　　IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
　　4.　试剂及器材:
　　(1)　0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
　　(2)　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:
　　0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml
　　0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
　　加蒸馏水至2,000ml。
　　(3)　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
　　　　　　　Na２CO３ 0.32克
　　　　　　　NaHCO３ 0.586克
　　　　　　　加蒸馏水至50ml
　　再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
　　(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):
　　临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。
(5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

　　在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
　　酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
　　其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。
　　结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
　　要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到最适的实验条件。

　　1.　在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(最低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的首要条件。
　　2.　所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。
　　3.　室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
　　4.　浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。

（一）酶标抗体的条件
1．纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。
2．特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3．效价高 一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
（二）酶标记方法
1．交联法  交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作：①抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)；②抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
⑵ 二步法：是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作：将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步标记法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2 500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。
2．氧化法  采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。
（1）氧化法操作过程如下：将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。在3ml HRP－醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h~3h，加入5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。
（2）改良过碘酸钠法：①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min；② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置4℃2h；⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；⑥次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体(HRP－IgG)结合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；⑦效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。
表  戊二醛法与过碘酸钠法比较
比较项目
 戊二醛法 过碘酸钠法

 一步法 二步法 
标记方法 简单 较复杂 较复杂
酶利用率 2～4% 2～4% 70%酶偶联到99%抗体上
产率 ＜5% ＜5% ＞50%
标记抗体分子量 750万 ＜25万 ＞40万
穿入组织能力 差 好 一般
抗体活性丢失 多 少 较多
酶活性丢失 多 少 较多
染色效应 差 较好 较好
3．二马来酰亚胺法  二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α－巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘－Ｏ－苯二马来酰亚胺活化，然后除去多余的试剂，最后使含二马来酰IgG与含硫基的β－半乳糖苷酶连接。具体操作如下：将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα－巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘－O－苯二马来酰亚胺溶液，混合，于30℃温育20min，过SephadexG25柱，除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β－半乳糖苷酶，置30℃20min，用0.10Mol/L NaOH中和后，于4℃置24h~72h，再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物，加叠氮钠(NaN3)防腐，4℃保存备用。
（一） 酶标抗体结合物的纯化 
在酶标记的溶液中，出现的是各种交联物的混合物,有酶－抗体、酶－抗体－酶、抗体－抗体、酶－酶，甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体－酶和酶－抗体－酶外,其它都应该给予除去。
1．50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶－酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。
2．过SephadexG200或Sepharose－6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。
（三）酶标抗体的鉴定
1．酶标抗体的活性鉴定  一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1：16以上。
2．酶结合物的定量测定  包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
（1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nm－OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度，抗体与酶－戊二醛结合后OD280nm约增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg，所以又乘以0.62)。
（2）过碘酸钠法：IgG(mg/ml)=(OD280－OD403×0.30)×0.62
 
(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。
⑸ 酶标记率：OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体－酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。
3．酶结合物的质量标准  纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。
（1）酶的催化活性。
（2）免疫学活性。
（3）未联接的游离酶的量。
（4）未联接的原始免疫反应物的量。
（5）每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。
（6）生化性质。
（7）酶标记免疫试验效果。
酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRP－IgG结合物进行酶标记免疫试验，可得到不同的试验结果，故应予重视。
  表 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数
评价 最好 好 一般
酶结合量(mg/ml) ≥1.0 ≥0.5 0.4
酶结合率(%) ＞30 9～10 7
酶IgG克分子比 ＞1.5 1.0 0.7
（五）酶标抗体的保存
分装小瓶，冻干低温保存。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反复冻融。保存期：一般1～2年活性不变。

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。
（一） SPA的理化性质 
SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。其分子量因测定方法不同而有所差异。
SPA的部分理化参数见表。
表  SPA部分理化参数
分子量 42 000
沉降系数S 20w(ˊS ) 2.10
扩散系数D20W(cm2/s) 4.3×10－7
Stocks半径(nm) 5.00
摩擦比f/f,min 2.10
粘度(n) (ml/g) 2.90
Hμggins常数 0.66
比容V(ml/g) 0.72

（二） SPA的免疫学性质 
SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；对大白鼠、绵羊的亲和力差；对马、犊牛、山羊等无亲和力；对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类（除少数例外）均不能与之结合。鸡的IgG必须与相应的抗原形成复合物才能与SPA结合，原因可能是Ag－Ab复合物改变了IgG的Fc片段的构象。
SPA与IgG结合的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4。
SPA除与IgG结合外，还能与血清中少量的IgM和IgA结合，SPA菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG为90%～98%，IgM为2%～30%，IgA为1.5%～20%。
出现共沉反应的SPA与IgG必须有两个结合部位，它们分别在Fc和Fab段上,缺一虽能与SPA结合，但不出现共沉反应，这种Fab的参与并非SPA－抗体反应。现已研究表明，IgG与SPA的结合部位是CH2和CH3的交界处。
（三）SPA的生物学特性
1．免疫原性与过敏原性  SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。
2．抗吞噬作用  由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。
3．固定补体  SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。
4．促有丝分裂因子  SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。
5．去封闭作用  固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。
（四）SPA的应用  SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能力，主要应用方面如下：
1．SPA菌的协同凝集作用
用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。
协同凝集只适用于检测抗原，未见应用于检测抗体的报道。
2．作为广谱第二抗体  用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点：①SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制；②SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103 L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。无论在0℃、37℃、44℃及56℃几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决；③SPA容易标上125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合；④在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗IgG特异性；⑤用第二抗体做免疫沉淀试验时，必须将抗免疫球蛋白的浓度调整至等价，才能产生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀，不受此限制，能保证彻底的沉淀；⑥SPA与lgG结合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、盐酸(pH2.5)或鸟嘌呤盐酸盐等都可以使之重新解离。
3．用于提取纯化IgG  利用SPA与IgG的结合特性提取IgG，比常规采用硫酸铵、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度离心等法要简便得多，而且纯度好。
4．检测和提纯IgM   IgM在病毒的早期诊断中具有重要意义，为了检测特异性IgM抗体，必须首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的办法，利用此法也为IgM的提纯开辟了道路。
5．其它方面  用于免疫复合物的检测、体外激活补体功能试验、细胞表面标记以及肿瘤表面抗原的检测等。
（五）标准菌种
目前国内使用的大致如下：
1．含A蛋白的葡萄球菌菌株
⑴ No 1800株：系中国科学院微生物研究所保存的由上海市分离出的菌株，其SPA含量、活性及湿菌体收获量与Cowan 1株相似，且不易出现自凝现象。
⑵ Cowan 1株：为SPA丰富的日本引进标准株，中国科学院微生物研究所编号为ASI 1476
⑶ 799型菌株：从化脓性骨科病人的骨标本中分离出含SPA丰富的菌株。
⑷ 丹麦1972株：由丹麦引进。
2．不含SPA的葡萄球菌株
⑴ Wood 46株：由日本引进，编号为ASI 1477。
⑵ 乙5—株：遵义医学院保存的SPA菌株。
（六）培养基
常用的培养基配方如下：
1． 配方一
蛋白胨                                  10.00g
葡萄糖                                   1.00g
氯化钠                                   3.00g
Na2HPO4•12H2O                          2.00g
牛肉浸液(或5%牛肉膏)                 1 000.0ml
混合，调pH 7.8
欲配固体培养基则另加琼脂25.00g
2． 配方二
胰酶消化酪蛋白                            17.00g
大豆胨                                      3.00g
氯化钠                                      5.00g
葡萄糖                                     25.00g
K2HPO4                                     25.00g
混和，调pH 7.3
3． 配方三
 水解蛋白胨                                 10.00g
氯化纳                                       5.00g
牛肉膏                                       10.00g
酵母膏                                       25.00g
色氨酸                                       5.00mg
半胱氨酸                                    100.00mg
琼脂                                         40.0g
H2O pH 7.6                                  1 000.00ml
SPA的提取、纯化与鉴定编辑本段回目录（一） SPA的提取
SPA提取的方法很多，包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下：
1．煮沸提取法
⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上，37℃培养20h~24h。
⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下，配成10%(V/V)的悬液。
⑶ 水浴中煮沸1h，迅速冷却至4℃，4 000r/min离心20min，去沉淀。
⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5，然后4 000r/min离心30min。
⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min离心20min。
⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，.4 000r/min离心20min。
⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解，12 000r/min离心20min。
⑻ 上清液即为粗提SPA液。
⑼ Sephadex G100过柱，上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱，流速控制在每管2ml~3ml/20min，收集流出液。
⑽ 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性，将有活性的各管合并、浓缩或冻干。
2．溶菌酶消化法
⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris－HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。
⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。
⑶ 置4℃冷却后，以12 000g离心30min。
⑷ 取上清，调pH值至7.0。
⑸ 加硫酸铵，边加边搅拌，使溶液呈80%的饱和度，4℃过夜。
⑹ 12 000g离心30min。
⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。
⑻ 透析或过Sephadex G50除盐，即为粗制的SPA制品。
（二）SPA的纯化
1．DEAE－Sephadex A－25离子交换层析法
⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液平衡DEAE－Sephadex A－25柱。
⑵ 加样后，用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱12h~14h。
⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱，流速0.15ml~0.2ml/min，收集流出液，测OD275nm。
⑷ 测SPA活性(以对流免疫电泳)，能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。
⑸ 浓缩或冻干保存。
2．Sphadex G100凝胶过柱法
装柱、加样，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脱，收集洗脱液，如上法测定活性和蛋白含量。
3．亲和层析法
(1) 猪IgG的制备：取正常猪血清，硫酸铵提取 球蛋白，再过DEAE－纤维素－32柱，制得纯化的IgG，以0.1mol/L NaHCO3液平衡，配成4mg~5mg/ml溶液。
(2) 偶联：将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中，倾入容积为15ml的Sepharose－4B中，搅拌，同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0，反应8min，用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO3在2号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose－4B(在90Sec内洗脱完毕)，迅速加入IgG液15ml，于4℃缓慢搅拌过夜，次日以PBS充分洗涤，至洗出液OD280nm＜0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封闭残余活性基团，再以PBS洗至中性为止。
(3) PBS亲和层析：将粗制SPA溶于PBS液中，加入IgG－Sepharose－4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD280nm＜0.02为止，换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱，流速0.2ml/min，收集洗脱液，即为纯化的SPA，对流电泳检查SPA活性，收集，浓缩，保存。
（三）纯化SPA的鉴定
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，只出现一条沉淀带为纯品。据报道，常出现一条杂蛋白染色带。以亲和层析法提纯的纯度高。

（一） 基本原理 
由于SPA能与IgG的Fc片段非特异性结合，同时不影响Fab片段的活性,所以当带有SPA的金黄色葡萄球菌与抗体混合，再加入适量的相应抗原，结果会使出现的凝集反应更易于观察。它对颗粒性抗原和可溶性抗原抗体反应都有协同凝集作用。此方法简便、快速、便于推广应用。
（二）材料与试剂
1．金黄色葡萄球菌
(1) SPA阳性株：NO.1800株(国内分离株)比Cowan株(国际标准株)更为优越，在加热过程中，不易出现自家凝集，更适用于协同凝集实验。
(2) SPA阴性株：Wood 46株。
2．试用菌种  炭疽杆菌、枯草杆菌及蜡样芽胞杆菌。
3．炭疽免疫血清。
4．正常免疫血清。
5．培养基。
6．0.01Mol/L pH 7.4 PBS液，0.1%NaN3的0.01Mol/L pH7.4 PBS液，
0.5%福尔马林的0.01Mol/L pH 7.4 PBS液。
7．生理盐水。
8．磁力搅拌器等。
（三）操作方法
1．将N0.1800株接种琼脂斜面培养基上，37℃培养20h~24h。
2．以少量生理盐水洗下菌体，4 000r/min离心20min。
3．将沉淀的菌体用0.01mol/L pH7.4 PBS液洗3次，然后用含0.5%福尔马林的0.01mol/L pH 7.4PBS液制成10%(V/V)悬液，置室温下3h。
4．将悬液56℃水浴30min，离心，用PBS液洗2次。最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%悬液，即为SPA菌稳定液，置4℃冰箱备用。
5．将SPA悬液1ml(如从冰箱拿出，可再用PBS液洗一次)，加灭活的炭疽阳性血清0.1ml，37℃30min。
6．4 000r/min离心20min，去上清，沉淀用PBS液洗2次，最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%悬液，共10ml，此即为SPA菌的凝集用试剂。
7．取干净载玻片，用接种环取1滴已标记的SPA凝集用试剂，然后再从琼脂斜面上取少量待试细菌，充分混合，2min内纪录结果。
8．对照组的设置
(1) SPA阴性菌标记免疫血清对照。
(2) SPA阳性菌标记正常血清对照。
(3) SPA稳定液与炭疽杆菌凝集对照。
(4) 抗炭疽血清与炭疽菌凝集对照。
(5) 其它芽胞杆菌凝集试验对照。
（四）结果判定
强度以“＋~＋＋＋＋”表示：
＋＋＋＋： 2min内，菌体凝集成大颗粒，液体透明。
＋＋＋  ： 2min内，菌体凝集成较大颗粒，液体透明。
＋＋    ： 2min内，菌体凝集成较小颗粒，液体轻度透明。
＋      ： 2min菌体部分凝集成细小颗粒,液体混浊。
－      ：2min内，无凝集现象，或2min以上才能出现细小颗粒者。

(一) SPA－ELISA技术原理
SPA 能天然地与人及某些哺乳动物的IgG分子上的Fc片段结合，一个分子的SPA可以同2个IgG分子以化学共价键结合(这不是真正的免疫反应，又称为假免疫反应)，利用这个特性，以SPA代替IgG抗体而应用于ELlSA中。
(二) 材料与试剂
1．SPA－HRP结合物,可向有关生物制品厂购买，也可自制，制法如下：
(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。
(2) 加入0.1ml用无水乙醇配制的1%的1－荧光－2，4二硝基苯，室温(20℃)温和搅拌1h。
(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇，室温搅拌1h。
(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液充分透析。
(5) 加入经0.01mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液平衡的SPA 5mg/ml，于20℃温和搅拌2h~3h。
(6) 加入5mg KBH4，混匀后，4℃放置3h。
(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析过夜。
(8) 过Sephadex G100柱(100cm×2cm)，以0.5mol/L pH7.4 PBS液洗脱，流速10ml/h。
(9) 测OD403nm，集SPA－HRP活性部分。
(10) 将高活性组分合并，加入甘油(含30%)置低温保存。也可以采用过碘酸钠法，制法如下：①5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中；②加入无水乙醇配制1%1－荧光－2,4二硝基苯0.1ml，室温混合1h；③加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸馏水配制)室温中混合30min；④加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸馏水配制)，室温缓慢混合1h；⑤以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3缓冲液于4℃透析过夜；⑥加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室温缓慢混合3h即可。
(11) SPA－HRP活性测定：①取猪血清IgG10μg/ml 0.1ml包被反应板，4℃过夜，3×3min冲洗；②加入适量稀释的SPA－HRP溶液0.1ml，置37℃2h，冲洗3×3min；③加入底物显色，显色的深浅应与SPA－HRP的活性成正比。
2．稀释液  0.05Mol/L pH7.4PBS液。
3．包被液  pH9.6碳酸盐缓冲液。
4．洗涤液  0.02Mol/L7.4Tris－HCl缓冲液。
5．底物溶液  pH 5.6磷酸盐－柠檬酸缓冲液：
0.2mo l/L  Na2 HPO4(28.40g/L)   25.70ml
0.1mol/L  柠檬酸(19.20g/L)     24.30ml
H2O                        50.00ml
用前加40mg邻苯二胺,溶解后加30%H2O20.15ml。
6．终止液 2mol/L  H2SO4 1滴。
（三）操作方法
1．检测抗体
⑴ 包被：用pH9.6碳酸盐缓冲液将抗原稀释成50μg－100μg/ml，每孔加0.1ml，37℃感作2h后置4℃过夜。
⑵ 洗涤：以pH 7.4 Tris－HCl液洗涤3×3min。
⑶ 加样：用pH 7.4PBS－Tween液稀释被检样品，每孔0.1ml，37℃感作2h。
⑷ 洗涤3×3min。
⑸ 加SPA SPA经pH7.4 PBS－Tween液稀释后，每孔加入0.1ml，37℃30min。
⑹ 洗涤3×3min。
⑺ 加底物：每孔加底物0.1ml，置室温15min(避光)，再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)终止反应。
2．检测抗原
⑴ 包被：以抗体包被,此抗体必须用SPA不能结合的那些动物的lgG,否则会因为SPA同包被抗体结合而产生假阳性结果,包被条件同上。
⑵ 洗涤。
⑶ 加样。
⑷ 洗涤。
⑸ 加抗体：此抗体必须选用能与SPA结合的动物IgG，否则可因为SPA不能同此层抗体结合而发生假阴性结果。
⑹ 洗涤。
⑺ 加SPA。
⑻ 洗涤。
⑼ 加底物及终止反应。
3．检测培养细胞内病毒抗原
⑴ 盖玻片培养单层细胞。
⑵ 接种易感病毒。
⑶ 用甲醇固定细胞。
⑷ 加抗血清于盖玻片上,37℃孵育1h。Tris－HCl液3×3min洗涤。
⑸ 将PPA滴加在盖玻片上,37℃孵育30min。
⑹ 洗涤3×3min。
⑺ 将盖玻片置底物溶液中,室温15min。
⑻ 以pH7.4 Tris－HCl液稍加冲洗后即可镜检。
(四) 结果判定
1．检测抗体或抗原
⑴ 眼观判定：在对照组成立的前提下,和标准阳性孔相近颜色者,均判为阳性(＋)。
⑵ 酶标仪测定：以空白对照孔调零，标准阳性样品校正至某一规定值，测定待测孔，当待测孔OD值或计算值达某一规定阈值时，判为阳性。
2．检测培养细胞内抗原  镜下观察，凡细胞内或细胞膜上出现棕黄色颗粒者，判为阳性。
（五）注意事项
1．目前使用的聚苯乙烯塑料板对抗体的吸附性能较好,，因此对于抗原，特别是大分子(分子量＞100万)的抗原应该进行一些适当的处理,如DNA,应将其事先冻融，使其变成较小分子再包被，如脂蛋白则应改变包被的温度，可在37℃包被过夜。
2．由于SPA－ELISA的敏感性极高，因此也很容易出现非特异性显色,排除非特异性显色的方法除了纯化抗原抗体外，还应该注意：
⑴抗原包被后，再以牛血清白蛋白包被一次或稀释液中加入1%的牛血清白蛋白均可，以占据未包被的一些空隙。
⑵检测血清抗体时，需事先检测大标本量的正常血清效价水平，在检测待检标本时，减去正常的血清效价。
⑶ELISA法加入标记物后往往37℃孵育2h，SPA同IgG的结合不是免疫反应，而是一种化学反应，一般认为，这种结合可能在极短的时间内发生,所以加PPA后，孵育时间可以缩短到0.5h。孵育过久，反而可因为SPA本身吸附到反应板上，造成非特异性显色。
3．叠氮钠对SPA显色影响较大，所以在SPA-ELISA过程中，不宜加叠氮钠做防腐剂，在组织细胞培养固定，也不适宜用甲醛固定，而需采取甲醇或乙醇。

(一) 原理
将SPA偶联至Sepharose－4B上后，利用亲和层析来提取人和某些动物的IgG，这样可以省去制备第二抗体。该法特别适用于单克隆抗体的研究。该法提取IgG与利用IgG纯化SPA原理是一致的。
(二) 材料与试剂
1．Sepharose－4B琼脂糖
2．SPA
3．溴化氰
4．0.10Mol/L NaHCO3液
5．pH3.2盐酸－甘氨酸液
6．生理盐水
7．待提取的IgG样品
8．层析柱(2cm×10cm)
9．磁力搅拌器
10．751分光光度计
(三) 操作方法
1．Sepharose－SPA的制备 在50ml三角烧瓶中加入蒸馏水20ml，加入固体溴化氰1.4g，加盖后温和振荡，使之溶解。倒入已盛有琼脂糖珠(4B)的烧杯中，立即搅拌，并滴加2mol/L NaOH溶液，边加边搅拌，使pH维持在11。反应6min后，倒入布氏漏斗，迅速以预冷的0.1mol/L NaHCO3溶液500ml抽滤洗涤已活化的琼脂糖珠。洗涤时间不超过90Sec，立即将此琼脂糖珠加入预先以0.1mol/L NaHCO3平衡的SPA液10ml中(10mg/ml)，于4℃搅拌16h～20h，此即为Sepharose－SPA的吸附剂。
2．将Sepharose－SPA低速离心5min，以生理盐水洗涤2－3次，除去未偶联上的SPA，然后装入2cm×10cm层析柱中，用生理盐水200ml洗至洗液OD280nm＜0.02。
3．亲和层析 将欲提取的IgG样品用生理盐水做1:5稀释后，加入Sepharose－SPA层析柱，以生理盐水洗脱，流速20ml/h。IgG被柱上的SPA吸附住，其它蛋白质随洗脱液流出。以生理盐水洗至洗脱液的OD280nm＜0.02为止。
4．解吸附  以pH2.0盐水－甘氨酸缓冲液进行洗脱，将洗脱下来的蛋白液迅速以1mol/L的NaHCO3液中和至pH 7.0，此即为提纯的IgG。
5．将收集的IgG液测定其蛋白含量、活性和纯度后，浓缩、分装、低温保存备用。
6．Sepharose－4B－SPA柱复生 采用7mol/L尿素洗柱后，再用生理盐水洗涤，最后用PBS液平衡后，可重复使用。
（四）结果判定
1．IgG的收集量。
2．IgG的纯度鉴定  可采用圆盘电泳或免疫电泳进行鉴定。
3．IgG的活性鉴定  可采用抗该IgG的ELISA试验，以鉴定IgG的活性。

A 直接法
1．标本固定。
2．PBS洗涤2×3分钟。
3．1％ H2O2（或1％ H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。
4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。
5．滴加酶标记的抗体37℃1小时或4℃过夜。
6．PBS洗涤3×3分钟。
7．DAB＋H2O2显色5～10分钟，镜下控制染色结果。DAB＋H2O2应用前15分钟配制。
8．充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。
 
B 间接法
1．标本固定。
2．PBS洗涤2×3分钟。
3．1％H2O2（或1％H2O2 甲醇）抑制内源性过氧化物，室温10～20分钟。
4．正常血清（1：10）孵育，室温20分钟。
5．滴加第一抗体，37℃1小时或4℃过夜。
6．PBS洗涤3×3分钟。
7．滴加酶标二抗，室温1小时。
8．PBS洗涤3×3分钟。
9．0.04％DAB＋0.03 ％H2O2显色5～10分钟。
10．  充分水洗后，复染、脱水、透明、封片、镜检。
 
C PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法）
1．标定固定后，PBS洗涤。
2．1％H2O2（或1％H2O2 甲醇）阻断内源性过氧化物，室温10～20分钟。
3．PBS洗涤2×3分钟。
4．正常血清（二抗的正常血清）孵育，室温20分钟。
5．滴加一抗，室温1小时或4℃过夜。
6．PBS洗涤3×3分钟。
7．滴加二抗，室温30分钟。
8．PBS洗涤3×3分钟。
9．加PAP复合物，室温60分钟。
10．  PBS洗涤3×3分钟。
11．  0.04％DAB＋0.03％ H2O2显色5～10分钟。
12．  充分水洗。
13．  苏木精复染，封片观察。
 
D 双PAP法
1～10同单PAP法。
11．  二次加酶标二抗。
12．  PBS洗。
13．  二次加PAP。
14．  PBS洗。
15．  0.04％DAB＋0.03 ％H2O2显色5～10分钟。
16．  苏木精复染核，封片，镜检。
 
E ABC法（卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法）
1～8同PAP法
9）加ABC液，室温60分钟。
10）  PBS洗。
11）  0.04％DAB＋0.03％ H2O2显色5～10分钟。
12）  充分水洗。
13）  苏木精复染核，封片，镜检。