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酶联免疫吸附试验(ELISA)测定伤寒杆菌“O”抗体

标签: 酶联免疫吸附试验 ELISA 测定 伤寒杆菌 “O”抗体

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酶联免疫吸附试验是用酶标记的抗体(或SPA)检测未知抗原或抗体的方法。此法敏感性高,特异性强。常用的是ELISA方法,间接法,双抗体法和抗原法。本次试验介绍,酶联葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下,见图9 

1、加抗原使之吸附于固相载体(如塑料反应板) 

2、洗涤加待测血清 

3、洗涤加酶标记SpA 

4、洗涤加酶的底物。经酶的催化产生有色产物。

一、材料: 

1、聚乙烯塑料反应板(PH9.6时可吸附蛋白Ag) 

2、抗原:伤寒杆菌O901煮沸或超声波粉碎抗原 

3、待测血清 

4、冻干酶联葡萄球菌A蛋白(HRD-proteinA)纯品 

5、邻苯二胺(OPD) 

6、包被液:0.05M碳酸钠-碳酸氢钠溶液PH9.6 

7、稀释液:10%免疫血清PBS-吐温20,防止非特异性吸附 

8、洗涤液:0.02MTrisTWeen20,Ph7.4防止非特异性吸附 

9、底物溶液:0.02M磷酸氢二钠25.7毫升 

0.1M柠檬酸24.3毫升 

蒸馏水50毫升 

临用前新鲜配制,在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺,然后加入30%双氧水0.15毫升,底物对光敏感,需要避光并立即使用。 

10、终止液;2M硫酸 

二、方法: 

1、抗原包被 

取洁净的聚苯乙烯微量反应板,于每孔内加伤寒抗原0.1毫升(用包被缓冲液稀释,蛋白含量10微克/毫升),置37℃1小时,弃抗原液,用洗涤液3次每次3分钟。 

2、加待测血清 

于每孔内分别加不同稀释度(如1:5,1:10,1:20…1:80)的待测血清,PBS空白对照,阴性对照血清,阳性对照血清各0.1毫升。置37℃30分钟,洗涤3次。 

3、加酶联A蛋白 

于每孔加酶联A蛋白各0.1毫升,置37℃20分钟,洗涤3次。 

4、加临时配制的底物溶液各0.1毫升,置暗处15分钟。加2M碳酸1滴终止反应。 

5、结果判断:(肉眼判断) 

若颜色于阴性对照相同则为阴性,若较阴性对照深则为阳性,根据颜色深浅以(+)表示。

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