钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。因此，钙离子测定在医学实验研究中有着重要意义。

钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂（或称荧光探针），二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。

一、荧光钙离子测定常用技术

1、荧光显微镜测定法

是一类以荧光显微镜检测为基础的测量技术，可用来分析单独的完整活细胞中钙离子的分布和功能分子动力学。然而，钙离子指示剂的性质易受细胞内环境（如pH）的影响，而且在多种细胞内现象中可见许多分子的浓度、分布、功能会同时或相应地发生一系列变化，为了研究这些细胞内现象的机制并排除测量准确性的干扰，目前多采用多参数分析。

（1）多参数数字化荧光显微镜系统（Multi-parameter digitized video microscope）

多参数数字化荧光显微镜系统可允许观测单一活细胞被多种荧光指示剂标记的情况，对细胞内特定物质（细胞参数）发生特异性荧光反应。组成该系统的几个主要部分是：装有相差或微分干涉相差的倒置（或正置）荧光显微镜、CCD数码相机（一般为高速、高灵敏度冷CCD）、可进行荧光钙离子浓度测定的图像工作站，荧光激发光源采用氙灯或汞灯，也有用激光的情形。在荧光激发光路上放置有滤光片转轮，由软件经开关装置控制不同激发波长滤光片的转换，见图1。CCD相机相当于一个检测器起到荧光信号检测和图像采集双重作用，采集到的荧光强度信号与钙离子浓度成正比，经软件分析得出细胞内钙离子浓度，钙离子浓度的基本计算方法见下式：

①单波长测定

[Ca2+]=Kd（F－Fmin）/ （Fmax－F）

式中Kd为荧光剂与Ca2+形成复合物的解离常数。Fmin和Fmax为最小荧光强度和最大荧光强度。

②双波长测定

系用比值（Ratio）信号来计算细胞内游离Ca2+浓度，不必校正。即：

[Ca2+] = Kd（Fd/Fs）（R－Rmin）/ （Rmax－R）

式中Fd和Fs分别表示荧光剂没有结合Ca2+和被Ca2+饱和时在340/380 nm（对于Fura-2）处的荧光强度；R为实验观察到的荧光比值；Rmin为细胞内荧光剂最小量结合Ca2+时的荧光比值，Rmax为胞内荧光剂被Ca2+饱和时的荧光比值。

（2）激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope，LSCM）

用常规荧光显微镜检测时，空间分辨率常受到部分处在焦点外的荧光信号造成的图像模糊所限制，背景荧光过强会降低图像对比度和清晰度，而纵向分辨力也不尽理想；每次观察是以焦平面作为对比度最好的层面，观察到的荧光是整个物质厚度的荧光强度之和，这样会导致量化测量的错误，特别是分析包含多层细胞的标本时会受到背景信号的干扰，激光扫描共聚焦显微镜的发明极大地克服了这种缺点。

LSCM是通过移动扫描点采集图像，并通过与扫描焦点处共聚焦位置的针孔收集发射的荧光信号，排除了焦点外荧光，从而可提供更高的垂直和水平的空间分辨率。LSCM 能够产生薄而且不模糊的光学层面，提供对感兴趣的参数区域进行三维空间重建成像的可能，理论上讲能提供更准确的功能离子浓度值[3]。初期LSCM 最重要的机械限制是在激发波长和时间分辨率上缺少变化，由于使用的光源通常是氩离子或氩氪激光激发波长范围受限，后来有了UV激发激光器这一问题。

（3）双光子激发的激光扫描显微镜（Two-photon excitation laser scanning microscope，TPLSM）

双光子激发是指同一个荧光探针分子同时被两个独立的光子激发，由于激发波长的能量和其波长成反比，如果激发波长加倍，能量就降至一半。如果两个独立的光子同时激发靶荧光素，实际的激发能量在理论上相当于一个光子在一半的波长激发，因此可使用长波光激发一般在紫外范围内激发的染料[4]。长波长激发具有光损害和细胞毒性低及受背景或溶液的散射限制小并能更深地进入标本等优点，有利于脑片、皮肤等较厚标本的钙离子检测。

（4）时间分辨荧光存留时间成像显微镜（Time-resolved fluorescence lifetime imaging microscopy，TRFLM）

用TRFLM分析功能性离子和常规的荧光显微镜有所不同，存留时间（lifetime，τ）是指荧光分子处在激发状态没有返回基态之前的时间，当两种不同τ值的荧光复合物用短脉冲激发时，激发分子发出的荧光与每个τ的长度有时间依赖性。尽管τ值不受散射、背景的衰减特性、光路长度、荧光素数目（浓度）、光漂白、控制荧光强度测量等其他因素影响，但τ值对荧光素所在的化学和环境参数非常敏感。此外，探针与非选择性离子的结合或具有不同τ值的不同种指示剂复合物的存在都会降低范围。用某种钙离子指示剂由TRFLM测得的钙离子浓度和用常规荧光显微镜测量时的范围会有所不同。TRFLM的钙离子指示剂包括calcium green、fluo 3、quin 2，在和钙离子结合后它的平均τ值变化很小，当钙离子浓度在100-150nM 时达到饱和（平均τ值的变化）。Calcium crimson、calcium orange和某些Ratio指示剂（如fura 2），在大范围的钙离子浓度变化时τ的变化很敏感[5]。某些Ratio指示剂对钙离子非敏感性类型产生光损害并在发射光谱上发生转移，尽管很难正确估计它们在强度基础上的Ratio测定效果，TRFLM可反映出这些产物的存在并能精确测定钙离子浓度变化。以存留时间为基础的钙离子测量比以强度为基础的持续状态测量的另一个突出优点是可避免校正所存在的问题。在持续状态，某些钙离子指示剂的荧光强度被局部环境所影响，这就使得校正和测量变得复杂。用存留时间测量钙离子浓度的原理是建立在钙离子结合态指示剂的τ值与游离态的有所不同之基础上，当钙离子浓度变化时，钙离子结合态或游离态指示剂的τ值并没有发生变化，但结合态和非结合态指示剂的作用（幅度）系依据平均τ值变化。重要的是某些特定钙离子、pH等指示剂的τ值受环境影响很小，则降低了在体内体外校正间的差异，使校正变得更简单而准确。TRFLM还有许多其它方面的潜在应用，如测定其它离子和细胞内物质（如NADH）。

2、荧光分光光度测定法（Fluorescence spectrophotometer）

荧光分光光度计是广泛用于测定生物样品的仪器，灵敏度高达可检测出10-12克数量级的物质，同样也可用做钙离子浓度测定，但一般适于多细胞样品，如采用显微操作制备单细胞也可完成。某些荧光分光光度计可选配专用测定细胞内钙离子浓度的装置，采用恒温微量池，在磁力搅拌器作用下细胞呈均匀悬浮分布，经340nm和380nm波长切换进行Ratio测定。测定结果遵循单波长和双波长计算公式。

近年来，荧光微板阅读仪（Fluorescence microplate reader）的发展使得多样品测定可同步完成。

3、流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）

流式细胞仪或称荧光激活细胞分选仪（Fluorescence activated cell sorter，FACS），在识别、分选钙离子荧光探针标记细胞的同时完成钙离子浓度测定。流式细胞仪的局限性是不能测量非同步化细胞中的钙离子动态变化，是由于相位差的变化和时间平均掩盖了在单一细胞内钙离子信号的变化，因此流式细胞仪更适用于测量整个细胞的反应。

二、钙离子荧光指示剂的标记和潜在的应用问题

1、钙荧光指示剂及其标记

对钙荧光指示剂的开发经历了以下过程：

第一代钙荧光指示剂，包括Quin 1、Quin 2、Quin 3，其中Quin 2的准确度较高，对钙的亲和力强，适于静态细胞钙的测定，在339nm激发后，与Ca2+结合后的发射荧光会增高5~6倍；当在365nm激发时，发射荧光降低，这样就可用它做双激发Ratio图。但有对温度敏感、激发波长较短、光稳定性差等缺点，且所需的Quin 2浓度较高，要达到0.5mmol/才能高出背景荧光，由于用UV激发会产生较强的细胞毒及自发荧光干扰。

第二代钙荧光指示剂，包括Fura 1、Fura 2、Fura 3、Indo 1，其中Fura 2最好。Fura 2是典型的双激发荧光指示剂，与Ca2+结合后导致荧光光谱移动，当被Ca2+饱和后，340 nm处激发荧光强度上升3倍，而380 nm处激发荧光强度下降10倍，340nm/380nm的荧光强度比值能够更好的反映Ca2+浓度变化，故准确度较高。与Quin 2相比，Fura 2分子中的吠喃环和晤哇环提高了它的离子选择性和荧光强度。Indo 1也是典型的双发射荧光指示剂，具有Fura 2的优点，不同的是在350 nm激发后的发射峰由游离态时的485 nm移至饱和态时的410 nm ，410/480 nm的荧光比值与Ca2+浓度成正比。

第三代钙荧光指示剂，Fluo 3是典型的单波长指示剂，吸收和发射峰分别位于506 nm和526 nm，可以在远离340～380 nm波长范围内测得荧光。Fluo 3结合Ca2+后的荧光强度比游离态的高出35～40倍，从而避免了透镜吸收和细胞自身的荧光干扰。Fluo 3是一种长波指示剂，激发波长（488nm）位于可见光，光源易找到，价格便宜，对Ca2+反应灵敏，目前受到广泛的应用，可作为激光共聚焦成像以及与其它类型荧光指示剂结合作双标记研究当使用单光子或多光子激光激发时，由于激发波长是固定的，所以应该选择合适的指示剂使它在激光波长范围内能够产生最大的吸收，因此钙离子指示剂的发射波谱是最重要因素。在选择指示剂时需要考虑的另一个因素是它们的化学形式，现在商品化的钙离子指示剂有盐类（酸）、酯类和葡聚糖结合物，指示剂的化学构成形式不同，将其导入细胞时所采取的方法也不尽相同。选择指示剂时还需考虑的重要因素是钙离子结合的亲和性，反映在解离常数（Kd）上，当钙离子浓度在0.1×Kd~10×Kd范围变动时，指示剂的吸收和发射波谱或发射的荧光强度随之发生变化。

根据钙荧光指示剂的种类不同标记的方法也略有差异，常用的标记方法有酯标记方法、显微注射法、膜片阊技术、利用缝隙连接分布、ATP诱导、刮除标记、脂转移标记、电击法、酸导人法等。在使用中潜在的问题主要有细胞内缓冲作用、细胞毒性作用、自发荧光、光漂白、隔室化和染料渗漏等，随着新型钙荧光指示剂的不断出现和标记技术的改进，这些问题逐渐在减少。

2、钙荧光指示剂的校正

如果想从测量出的荧光信号中精确地计算出钙离子浓度，首先必须进行校准。由于荧光指示剂的Kd值受所在环境影响很大，因此，在实验条件下估算Kd值是很重要的，主要有两种校准方法：体外校准和体内校准。

（1）体外校准

校准曲线是通过含有活化形式（非酯类）钙离子指示剂的钙离子缓冲液得到的，EGTA- Ca2+缓冲液是最常用的用于校准的钙指示剂，通过将两种溶液（溶液A含有10mM EGTA，溶液B含有10mM Ca-EGTA）按不同的比例混合得到含有不同钙离子浓度的校准溶液[9]。这两种溶液都含有同样浓度的K+（100~140 mM），缓冲液（MOPS，HEPES，等），如果需要还有其它离子，它们调整到同一pH值和同一温度。由于，EGTA对Ca2+的Kd值受温度，pH值，离子力和其他重金属离子浓度的影响，所以，在校准钙离子指示剂之前，必须精确估计缓冲液中钙离子浓度。

（2）体内校准

在体外校准时，许多荧光钙离子指示剂Kd值和实际细胞中的并不完全相同，这种差异主要是由于含有荧光钙离子指示剂的细胞的Kd值受温度、pH值、粘度、离子力和其它细胞内成份的影响。这样，在一种细胞内测得的Kd值并不适用于其它类型的细胞，细胞内环境因素会影响钙离子指示剂的某些光学参数。此外，不是所有酯化形式的钙荧光探针完全水解的，任何乙酰羟甲基酯（AM）残基会影响观察细胞的荧光强度和量化的准确性，由于非水解型钙离子指示剂是钙离子不敏感型的，对它们荧光信号的测量会低估了钙离子浓度，因此，最好用体内校准法校正荧光强度。