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丁香园论坛关于显微镜问题汇总(三)

标签: 丁香园 显微镜

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chujun_hust:我现在已经筛选出高表达EGFP的细胞,我想测量细胞数量与GFP荧光强度的相互关系,我设计了一个方案:把不同个数的细胞接种到96孔板中(比如1X102~1X105个/ml),然后只利用倒置荧光显微镜测量出每孔的总荧光强度,不知道能不能测出来啊?????不知道怎么测啊?或者有没有其它好方法啊?

schoman:还是用流式来测吧,比荧光显微镜方便,结果好。流式现在到处都是,而且又不需要特殊处理,只要消化处理成为单个核细胞就可以上机检测了。可以准确的检测出细胞的相对荧光强度。

lalal308:我现正在进行钙火花的测定,由于设备原因而不能测定具体困难如下:
  1、有关MRC-1024激光共聚焦显微镜进行钙瞬时测定(即测定钙火花)的具体方法、设备的使用参数。
  2、哪有先进的激光共聚焦显微镜,能进行钙火花的测定,并可以接受外来人员。

murong:据我所知,国内很多单位是买了激光共聚焦显微镜,而且一般都有对外服务业务,您最好说明一下自己是哪里的,那样方便战友为您提供有用的信息。

tgsslan:我要给某链霉菌用血球计数板计数,请问一定要用油镜观察吗?没有油镜的情况下,用普通的物镜可以吗?

mutongfeige:对于真菌来说,用40倍物镜进行计数应该够了,但要注意将光线调暗一点,才好观察。

yanghao:我觉得还是用油镜好,因为用高倍镜的话,不能清楚的分辩链霉菌,计数的话不准确且不能与其他的G-菌区别,如果要求不高的话当然也可以用40倍镜。如果是霉菌还可以用美兰简单染色,我是学检验的,我试过很多。

roc7464112:不要用油镜,用40倍就可以,但是要调好:灯光的亮度,彩虹光圈的大小,聚光镜的位置,一般把新把彩虹光圈调到最大,再调整灯光的亮度和聚光镜的位置,直至不太亮,再对焦,然后左手调光源大小,右手调聚光镜的位置,直至刻度线和菌都能看清楚。有必要的话还有再调一下聚焦微调。

yxssdoctor:一定不能用油镜,理由如下:当用镜检对微生物计数时,菌体较大的酵母菌或霉菌泡子应该采用血球计数板;一般细菌则采用彼得罗夫-霍泽细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,应该使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜。

celia_xl:最近我们系买了一台CONFOCAL,我想现在有很多单位都已经使用了,所以我想这些同志能否谈谈CONFOCAL的用途,使用心得,让大家也学习学习。

zxmshwo:根据我的印象,Confocal(激光共聚焦显微镜),又称为细胞CT,主要是对细胞内部结构进行定量、定性观察,和细胞内一些离子定量检测。主要适用细胞培养。

NewCureSeeker:共焦点荧光显微镜与普通荧光显微镜相比,有以下优点:
  1、Z轴上的分解能高。
  (1)可观察被染上荧光的物质在细胞里的分布:例如,是在细胞膜上还是在细胞核里。
  (2)即使组织标本较厚,也可获得鲜明的画像。
  (3)可了解组织的3D结构。
  2、高画质
  (1)通过调节pin-hole,不但可提高Z轴上的分解能,也可提高X-Y轴上的分解能。
  (2)可以在光学和电子两个水平调节对比度,因此可以从低对比度组织标本,拍摄到高对比度的图像。  

3、多重染色
  (1)多重染色时,各染料之间的cross-talk较少。
  (2)可使用Cy5染料 Cy5的激发波长是645nm, 荧光emission波长是670~680nm, 人眼的可见光 波长是390~750nm.
  注意点:
  (1)注意调节Koehler illumination。
  (2)与普通荧光显微镜一样,注意滤色镜的选择。

xyz2942:根据不同的倍数×10,×20,×40时看到的荧光强弱,可以打+、++来表示信号的强弱。有谁知道相关的标准呢?

llhawk:+/-:高倍镜下可疑
  +:高倍镜下隐约可见
  ++:高倍镜下较明显
  +++:低倍镜下明显可见
  ++++:低倍镜下刺眼

jchenone:我直接在目镜下面拍摄,但是效果较差,请问有什么好的办法?

ylcui:在倒置镜专门接相机的位置,把普通相机卸下,数码相机镜头对准那里(最好能加工一个接圈),效果一般还可以。但是这种变通方式得到的照片,也不是特别理想。

murong:注意在摄影接口那里是否配有摄影目镜,有的显微镜只有接口,没加摄影目镜(可选件)。那么你可以去厂家买一个。

pimaster:我是用DiI-acLDL检测内皮细胞,由于它是细胞的功能检测,必须是活细胞实验,之后置于共聚焦观察。我已经作过一次,是用DiI-acLDL加入培养基中,于常用细胞培养条件2~3小时后,直接用共聚焦观察,使用浓度按试剂说明。可是没有结果!因为是第一次,我不知到错在哪!请教各位能给我指点么?

czh4:你是通过检测什么指标反映功能变化的?我估计存在以下问题:
  1、试剂问题,由于你讲的不清楚,你自己考虑下。
  2、内皮细胞活性:由于是活细胞实验,细胞功能上首先必须是正常的;我不知道你做的是什么实验,最终是通过检测什么指标反映功能变化的,但我想道理都是一样的。解决方法是设立阳性对照,通过加入其它刺激剂,上调或下调内皮细胞功能,观察你所检测指标有无变化,如此时亦无变化,则很可能说明你培养的细胞功能上存在问题。
  举例说明:我曾在共聚焦下做过内皮细胞内钙离子浓度测定,有时上样后亦无反应,通过加入上调细胞内钙离子浓度的A23187或下调剂后,亦无反应,则说明问题很可能出在细胞本身。
  顺便问一句,你是在什么装置内培养细胞的?据我所知,一般培养瓶是很难在共聚焦载物台上进行操作的。

roosterjian:建议你将盖玻片铺在培养皿内,贴壁后实施预刺激等,加入染料待细胞摄取,然后取出来,固定,观察。另外,共聚焦的镜头通常是短工作距离的(小于1mm,为提高分辨率),要是在培养皿里观察必须用特殊的培养皿,厚度和盖玻片一样必须满足镜头的工作距离。我通常是先用长工作焦距的落射荧光镜观察,然后铺片上共聚焦。

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